Изучение ферментных систем дыхания

Работа 3. Окислительные ферменты дыхания

Из многих окислительно-восстановительных ферментов, вырабатываемых растениями, в данной работе исследуются только два:

1. Полифенолоксидаза - фермент, повышающий окислительный потенциал молекулярного кислорода, соединяя его с водородом, отщепляемым от полифенолов по схеме:

дифенол хинон

2. Пероксидаза - фермент, активизирующий кислород воздуха, окисляющий полифенолы и ароматические амины кислородом в присутствии перекиси водорода, например:

дифенол + Н₂О₂ → хинон + 2Н₂О

Обнаружить эти ферменты можно при помощи раствора гваяколовой смолы, которая при окислении активированным (атомарным) кислородом меняет свою окраску из коричневой в синюю. Работу удобно проводить на двух срезах исследуемой части растений, нанося на первый срез раствор гваяколовой смолы, а на второй - раствор гваяколовой смолы и перекись водорода. Посинение первого среза свидетельствует о присутствии в клетках полифенолоксидазы, тогда как посинение второго среза есть результат совместного действия двух ферментов: полифенолоксидазы и пероксидазы или в случае отсутствия в данном объекте первого фермента - одной пероксидазы.

ХОД РАБОТЫ

Поместить на тарелку 2 куска исследуемого объекта и облить оба куска одновременно раствором гваяколовой смолы, причем второй срез дополнительно обработать каплей раствора перекиси водорода. Для контроля обработать таким же образом материал, предварительно подвергнутый кипячению. Исследовать несколько объектов, не допуская при этом попадания сока из одного объекта на срез другого.

Результаты занести в таблицу:

Объект	Посинение при действии
	гваяколовая смола	гваяколовая смола +NaCl	гваяколовая смола +H2О2	гваяколовая смола + H2О2+NaCl
Картофель сырой
Картофель вареный
Редька
Луковица

Можно ингибировать полифенолоксидазу хлоридами, посыпав поверх среза клубня NaCl или BaCl, KCl, CaCl и т.д. Пероксидаза хлоридами ингибируется в меньшей степени, поэтому при добавлении перекиси водорода на срез, где была нанесена соль и добавлена гваяколовая смола, посинение все же происходит, хотя и менее интенсивно.

В целом данная работа подтверждает теорию А.Н. Баха об активации ферментами-оксидазами О₂ воздуха в заключительной стадии дыхания.

МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ

1) клубни картофеля, корнеплоды редьки, корни хрена и др.; 2) 1%-ный спиртовой раствор гваяколовой смолы; 3) 3%-ный раствор перекиси водорода; 4) тарелки; 5) скальпель.

Работа 4. Обнаружение редуцирующих ферментов при дыхании семян

ХОД РАБОТЫ

10 пророщенных семян гороха очищают от кожуры и разделяют на семядоли. Половину всех семян помещают в колбочку с водой и кипятят в течение 3 минут, считая после закипания, чтобы убить ферменты. Затем обе порции семядолей помещают в две пробирки с раствором метиленовой синьки и оставляют на несколько минут до посинения поверхности семядолей.

Семядоли отмывают водопроводной водой и заливают дистиллированной водой в пробирке так, чтобы слой воды был выше семян на 2 см, помещают на водяную баню с температурой 30-35°С.

Через несколько минут наблюдают полное исчезновение синей окраски у семядолей, не подвергавшихся кипячению вследствие превращения метиленовой синьки в бесцветное лейкосоединение.

В данном опыте метиленовая синька выступает в роли акцептора водорода.

структурная формула восстановленная

метиленовой сини метиленовая синь

(окрашенная, базоформа) (бесцветная, лейкоформа)

Подобный эксперимент можно проводить с зелеными частями высших растений, например, с элодеей, пеларгонией, колеусом и др.

Здесь четко прослеживается взаимосвязь восстановительной активности с возрастом растения.

В практической агрономии этот метод используется для определения жизнеспособности семян и отдельных органов растений, где об этом свидетельствует степень окрашенности (интенсивность) семян метиленовой синью (метод Нелюбова).

МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ

1) спиртовка; 2) пробирки; 3) баня; 4) колбочки на 50 мл; 5) раствор метиленовой синьки; 6) семена гороха или фасоли.

Работа 5. Обнаружение дегидрогеназ при спиртовом брожении

В нормальных условиях спиртового брожения образовавшийся в процессе декарбоксилирования пировиноградной кислоты уксусный альдегид

пируватдекарбоксилаза

СН₃-СО-СООН СН₃СОН + СО₂

восстанавливается с помощью фермента алкогольдегидрогеназы и ее кофермента НАД·Н₂ в спирт этанол:

алкогольдегидрогеназа

СН₃СОН + НАД·Н₂ СН₃СН₂ОН + НАД

Если ввести второй акцептор водорода, например, метиленовую синь, то последняя, присоединяя водород, будет переходить в лейкосоединение и раствор обесцветится.

ХОД РАБОТЫ

Убедиться в наличии дегидрогеназ при спиртовом брожении можно следующим образом. В колбу емкостью 100 мл внести 2 г прессованных дрожжей, прилить 20-30 мл 3%-ного сахара и хорошо взболтать. Затем прилить еще 40-50 мл раствора и снова взболтать. Взять 2 пробирки. Одну из них заполнить почти доверху раствором с дрожжами. Оставшийся раствор в колбе перекипятить в течение 3 минут, остудить и налить во вторую пробирку (контрольную). В обе пробирки внести 3-5 капель раствора метиленовой сини и закрыть ватными пробками. Поместить в водяную баню с температурой около 35°С.

Восстановление метиленовой сини в опытной пробирке начинается через несколько минут и вскоре раствор полностью обесцвечивается (20-25 минут). Раствор в контроле остается без изменения. Если, вынув ватную пробку из опытной пробирки, хорошо взболтать раствор либо продуть воздухом, то синяя окраска снова возвращается вследствие окисления кислородом воздуха образовавшегося лейкосоединения.

МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ

1) колбы на 50 мл; 2) 3%-ный раствор сахара; 3) прессованные или сухие дрожжи; 4) водяная баня; 5) пробирки; 6) спиртовка; 7) метиленовая синь; 8) ватные пробки.

Работа 6. Метод определения активности дегидрогеназ с помощью вакуум-инфильтрации (по Пыльневу)

В основу метода положена способность дегидрогеназ восстанавливать бесцветные соли тетразолия с образованием окрашенного формазана. Бесцветный ТТХ - 2,3,5-трифенилтетразолий хлорид, присоединяя водород, восстанавливается до формазана красного цвета. Формазан нерастворим в воде, но хорошо растворяется в ацетоне или изопропиловом спирте. Метод позволяет работать с малыми навесками материала и выявлять активность дегидрогеназ как бесцветных (что удобнее), так и окрашенных пигментами биологических тканях.

ХОД РАБОТЫ

При работе нужно выбирать однородный материал и разрезать крупные объекты на пластинки толщиной 1,5-2 мм. В маленькие бюксы берут навески по 30-100 мг предварительно разрезанного на пластинки растительного материала. Для навески заливают 5 мл раствора 2,3,5-трифенилтетразолия, приготовленного на буферной смеси; третью (контрольную) погружают в 5 мл чистой буферной смеси. Исследуемый материал сверху придавливают небольшим грузом (стеклянной пробкой) и помещают в вакуум-эксикатор, из которого масляным насосом выкачивают воздух, под давлением которого раствор начинает проникать в ткани. Бюксы закрывают крышками и переносят на 30 минут в термостат с температурой 31°С, где ткани приобретают красный цвет, интенсивность которого зависит от активности дегидрогеназ.

Затем каждую пробу вынимают из бюкса и тщательно растирают в ступке с небольшим количеством ацетона или изопропилового спирта. Содержимое ступки переносят в мерный цилиндр и доводят до 5-10 мл, в зависимости от интенсивности окраски. Остатки измельченной ткани должны полностью обесцветиться. После растирания все пробы центрифугируют в течение 3 минут при 1 500 оборотов в минуту и полученный окрашенный формазаном экстракт сразу колориметрируют на ФЭК при синем светофильтре. Если контрольная вытяжка зеленая, то чтобы снять цвет хлорофилла, колориметрируют при зеленом светофильтре. Активность дегидрогеназ вычисляют по разнице оптической плотности между показаниями ФЭК в опытных и контрольных пробах. Эта разница, выраженная в целых числах, названа индексом активности дегидрогеназ.

Результаты опыта записывают по следующей схеме:

Объект	Навеска ткани, мг	Оптическая плотность		Индекс активности дегидрогеназ
		контроль	опыт

Все три выполняемые в практикуме работы (4, 5, 6) служат ярким подтверждением теории В.И. Палладина об активации водорода (отщеплении от дыхательного субстрата) в анаэробной стадии дыхания.

МАТЕРИАЛ И ОБОРУДОВАНИЕ

1) проростки злаковых, клубни картофеля или другой растительный материал; 2) 1/15 М буферная смесь Серенсена III с рН 7,17; 3) 2,3,5-трифенилтетразолий хлористый, 0,25-0,5%-ный раствор, приготовленный на буферной смеси Серенсена III; 4) 85%-ный ацетон или изопропиловый спирт; 5) бюксы; 6) мерные цилиндры на 10 мл; 7) лезвия безопасной бритвы; 8) фарфоровые ступки; 9) весы торзионные или аналитические; 10) вакуум-эксикаторы; 11) насос Камовского; 12) термостат; 13) центрифуга; 14) ФЭК.

ПРИМЕЧАНИЕ. Для приготовления 1/15 М буферной смеси Серенсена с рН 7,17 в 100 мл дистиллированной воды растворяют 0,831г Na₂НРО₄× 2Н₂О и 0,272 г КН₂РО₄.

Работа 7. Определение активности каталазы в растительных объектах

Каталаза – очень распространенный дыхательный фермент, присутствующий практически в любом биологическом материале растений и животных.

В процессе дыхания в качестве побочного продукта окисления веществ образуется перекись водорода, оказывающая в высоких концентрациях токсичное действие на цитоплазму. Обезвреживание перекиси происходит при участии фермента каталазы (одна из его функций), разлагающей ее на воду и молекулярный кислород по уравнению:

каталаза

2Н₂О₂ 2Н₂О +О₂

Об активности каталазы судят по объему кислорода, выделяющегося в результате разложения перекиси водорода.

Для определения пользуются прибором, который состоит из каталазника, бюретки емкостью 50 мл и стеклянной груши, соединенных каучуковыми трубками и стеклянным тройником, каучуковая трубка на конце тройника снабжена винтовым замком. Бюретка и стеклянная груша закреплены на штативе. Их заполняют дистиллированной водой до половины объема.

ХОД РАБОТЫ

0,5 г листьев растирают в фарфоровой ступке с кварцевым песком и добавляют 0,5 г мела для создания щелочной реакции (рН=7,7 оптимальная для данного фермента).

Во время растирания вливают небольшими порциями 20 мл воды, смесь вносят в одно колено каталазника. В другое колено помещают 5 мл 3%-ной перекиси водорода. Каталазник соединяют с каучуковой трубкой, не допуская смешивания жидкостей.

Открывают зажим и перемещением воронки устанавливают уровень воды в бюретке на нуле. Закрывают зажим и быстрым изменением положения каталазника смешивают жидкость в обоих коленах. Затем все время потряхивая каталазник по снижению уровня воды в бюретке отмечают объем кислорода в мл, выделенного в течении 3 минут на 1 г массы сырого материала.

Во время опыта каталазник нельзя держать всей ладонью, так как при нагревании от руки воздух в колбе расширяется, что может повлиять на точность отсчета. При отсчете вода в круглой воронке и бюретке должна быть на одном уровне.

Определяют активность каталазы в листьях верхнего и нижнего ярусов. Можно использовать также проростки различных сортов сельскохозяйственных культур, различающихся по скороспелости к неблагоприятным воздействиям.

Результаты опыта заносят в таблицу:

Ярусы листьев на растении	Навеска листьев, г	Выделилось О2 за 3 минуты	Активность каталазы, мл О2 на 1 г сырого материала
Верхний	0,5
Нижний	0,5

МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ

1) растение с несколькими ярусами листьев, проростки пшеницы или другой культуры; 2) промытый речной песок; 3) порошок мела; 4) 3%-ный раствор перекиси водорода; 5) фарфоровые ступки с пестиком; 6) мерные цилиндры на 25 мл; 7) прибор для определения каталазы; 8) часы; 9) весы с разновесами.