Сшивка фрагментов с разноименными липкими концами

В ситуации, когда необходимо сшить фрагменты, образованные разными эндонуклеазами рестрикции, и имеющие разные, то есть некомплементарные друг другу липкие концы, применяют так называемые линкеры (или "переходники"). Линкеры - это химически синтезированные олигонуклеотиды, представляющие собой сайты рестрикции или их комбинацию. Часто в середину линкера помещают какой-либо регуляторный генетический элемент, например, промотор или участок, связанный с рибосомой. В этом случае линкеры обеспечивают не только объединение генов, но и обуславливают их экспрессию. Существуют линкеры "тупой конец - липкий конец".

Слайд 24. Перенос генов в клетки организма-реципиента.

Идентификация клеток-реципиентов.

Первая стадия – отбор клеток, несущий соответствующий вектор. Чаще всего проводится по генетическим маркерам, которыми помечен вектор.

Слайд 25. Можно выделить 2 группы маркерных генов, позволяющие отличить трансформированные клетки:

1. Селективные гены, отвечающие за устойчивость к антибиотикам (канамицину, тетрациклину, неомицину и др.), гербицидам (у растений). Это могут быть гены ауксотрофности по какому-либо субстрату и т.д.

2. Репортерные гены, кодирующие нейтральные для клеток белки, наличие которых в тканях может быть легко тестировано.

Чаще всего в качестве репортерных используются гены β-глюкуронидазы (GUS), зеленого флюоресцентного белка (GFP), люциферазы (LUC), хлорамфениколацетилтрансферазы (CAT).

Слайд 26. GFP (green fluorescent protein - зеленый флюоресцентный белок, или белок зеленой флюоресценции) Особые свойства белка GFP - способность флюоресцировать в видимой (зеленой) области спектра при облучении длинноволновым УФ. Эта флюоресценция обусловлена непосредственно белком, для ее проявления не требуется субстратов или кофакторов.

Слайд 27. Вторая стадия – поиск клеток, несущих не только вектор, но и ген-мишень. Для этого используют две группы методов.

1. Методы, основанные на непосредственном анализе ДНК клеток-реципиентов:

А) определение нуклеотидной последовательности ДНК;

Б) гибридизация выделенной из клетки ДНК с зондом.

2. Методы, основанные на идентификации признака, кодируемого геном:

А) непосредственный отбор клеток, синтезирующих белок – продукт транскрипции и трансляции гена-мишени;

Б) использование селективных сред, поддерживающих рост только тех клеток, которые получили ген-мишень;

В) иммунологическая детекция: применяется, если искомый ген в составе рДНК транскрибируется или транслируется, но никак не влияет на фенотип организма.