Культуральная среда
Осаждение Концентри-рование Концентри-рование
или фильтрация
Пред.обработка
Фильтрация
Сушка
Биомасса
Фильт-рация
Сушка
Экст-ракция
Нативный раствор
(
отход
производства)
Биомасса
(отход
Дезинтег-рация
производства)
Фракциони-рование
Нативный
раствор
Экстракция Ионный
обмен
Осаждение
Первый вариант выделения целевого продукта самый простой. На этой схеме базируется производство биотина (добавка к корму скота), основанного на использовании продуцентов антибиотика хлортетрациклина – стрептомицетов. Кальциевый комплекс хлортетрациклина осаждают из культуральной жидкости при рН выше 7,0. Формирующийся при этом осадок увлекает с собой и клетки продуцента. Так в осадке вместе с биомассой оказываются внеклеточный антибиотик и внутриклеточный витамин В12. Осадок отфильтровывают, сушат, измельчают. Добавляют отруби в качестве носителя и фасуют.
Вторая схема применяется, если целевым продуктом является биомасса клеток, например кормовые и пекарские дрожжи. В начале необходимо провести их концентрирование. При этом широко используют флотацию, с помощью которой увеличивают концентрацию дрожжей в 4 – 6 раз. Кроме того, для концентрирования можно использовать центрифугирование.
В третьей схеме приведены методы извлечения целевых продуктов из клеток биомассы. Полиеновые антибиотики, например, экстрагируют органическими растворителями из нативных клеток, тогда как эндоферменты получают из разрушенных (дезинтегрированных) клеток.
Выделение большей части продуктов микробного синтеза из культуральной жидкости (схема 4)начинают при их содержании около 1,5 %, но чтобы можно было эффективно выделять вещества из культуральной жидкости с помощью осаждения, кристаллизации, высушивания и др., культуральные жидкости необходимо подготовить к этим процессам. Для этого проводят обработку культуральной жидкости для коагуляции коллоидных примесей, получения хорошо отфильтровываемых осадков. Применяют несколько видов коагуляции: неорганическими солевыми электролитами, органическими и неорганическими кислотами, термической обработкой и другими эффективными методами коагуляции дисперсных систем является обработка их высокомолекулярными полиэлектролитами – флокулянтами, образовавшийся при этом осадок отфильтровывают, а из нативного раствора выделяют целевой продукт, используя экстракцию, ионный обмен, осаждение, кристаллизацию и другие методы выделения и очистки индивидуальных веществ.
Рассмотрим основные элементы постферментационной стадии выделения и очистки внутриклеточного продукта биотехнологичсекого производства:
Отделение биомассы от культуральной жидкости (сепарация):
Существует несколько способов сепарации: 1) флотация (применяется в том случае, если клетки продуцента накапливаются в верхних слоях биореактора), 2) фильтрация (для реализации данного способа сепарации применяют фильтры различных конструкций, например, барабанные, дисковые, ленточные, тарельчатые, вакуумные, мембранные; принцип их действия один и тот же: задержка биомассы на фильтрующей перегородке), 3) центрифугирование (метод основан на осаждении биомассы под действием центробежных сил; это очень эффективный, но дорогостоящий метод).
Дезинтеграция.
Разрушение клеток можно проводить следующими методами: физическим, химическим и физико-химическим.
К физическим методам относятся: разрушение ультразвуком, вращающимися лопастями или вибраторами, встряхиванием со стеклянными бусами, продавливанием через узкое отверстие с помощью высокого давления, размораживанием замороженной биомассы, растиранием в ступке, осмотическим шоком, замораживанием- оттаиванием (попеременно), сжатием клеточной суспензии с последующим резким уменьшением давлением (компрессия – декомпрессия). Для физических методов характерна высокая экономичность.
Химическая дезинтеграция связана с разрушением клетки под действием таких веществ, как ферменты, поверхностно-активные вещества (ЭДТА), бутанол, толуол, но по сравнению со спиртами более эффективны ферменты, кроме того, клеточная стенка может быть разрушена за счет ее обработки антибиотиками.
Отделение клеточной стенки от гомогената.
Отделение клеточной стенки от гомогената производится такими методами, как: центрифугированием, фильтрованием.
Отделение и очистка целевого продукта.
Данная операция проводится после отделения клеточной стенки. Культуральная жидкость или гомогенат идут на очистку с целью получения целевого продукта. Очистка осуществляется следующими способами: осаждением, т.е. перевод целевого продукта в малорастворимое или нерастворимое состояние (данный метод имеет следующие разновидности: физические и химические методы), экстракцией (применяются две ее разновидности: твердожикофазная и жидкожидкофазная), адсорбцией (имеет три разновидности: электрофорез, электрофокусировка, хроматография).
Концентрирование целевого продукта.
Необходимость проведения данной стадии обусловлена тем, что вещество после очистки находится в сильно разбавленном состоянии.
Основными способами концентрирования являются: обратный осмос, связанный с продвижением вещества против градиента концентрации через мембрану, т.е. данный метод основан на том, что внешнее прилагаемое давление должно быть больше осмотического; ультрафильтрация (этот метод является наиболее перспективным для концентрирования веществ и основан на отделении требуемого вещества с помощью полупроницаемой перегородки: на перегородке задерживаются крупные молекулы, а проходят через поры - мелкие); выпаривание (наиболее простой и старый метод концентрирования веществ, но существенным недостатком метода является то, что он осуществляется при повышенных температурах, в этом состоит ограниченность практического применения данного метода; для реализации данного метода применяют вакуум- выпарные установки).
Обезвоживание (сушка) целевого продукта.
Методов сушки существует очень много и поэтому выбор наиболее оптимального зависит от таких физико-химических свойств целевого продукта, как вязкость, термическая устойчивость и др.
Основными способами сушки являются: сушка на подносах, сушка с помощью различных видов сушилок (ленточных, барабанных и др.) и т.п.
Хранение целевого продукта.
Высушенный продукт направляется на стадию хранения, где ему, кроме того, придаются необходимые товарные качества или же при необходимости производится его химическая модификация (чаще всего в случае антибиотиков).
Стабилизация полученного продукта.
Стадия стабилизации целевого продукта направлена на сохранение его ценных свойств в период хранения или использования. Существуют различные способы стабилизации продукта, к ним относятся:
лиофильная сушка, основанная на том, что ферментную активность необходимо резко затормозить, охлаждение проводят в парах азота, а затем производят выпаривание. Преимуществом данного метода является длительное сохранение биологической активности.
высушивание на воздухе: высушивание на активированном угле, на агар-агаре, на шерстяных нитках.
сохранение спор, данный метод применяется для споровых микроорганизмов. Данный метод заключается в следующем: выращивают бациллы, затем создают условия для протекания эффективного спорообразования и затем осуществляют сохранение в виде спор.
криоконсервация, т.е. сохранение в глубоко замороженном состоянии: замораживание осуществляют жидким азотом; хранение осуществляют в криобанках при температуре –150 °С. При этом за счет резкого охлаждения затормаживаются все биохимические процессы, т.е. наступает состояние близкое к анабиозу.
комбинированные методы хранения.