2. Основные свойства ферментов.

Ферментами (или энзимами) называют белки с каталитическими свойствами, или, более точно, специфические белки, которые находятся во всех клетках и тканях организмов и играют роль биологических катализаторов. Вещества, подвергающиеся под действием ферментов разнообразным химическим превращениям, носят название субстратов.

Характерной особенностью ферментов, отличающей их от других катализаторов, является чрезвычайно высокая активность.

Например, одна молекула каталазы – фермента, катализирующего разложение пероксида водорода на воду и атомарный кислород, способна расщепить в одну минуту до пяти миллионов молекул перекиси водорода. При сравнении каталитических способностей каталазы и иона железа в этой реакции установлено, что 1 мг каталазы эквивалентен по действию 2 г железа.

Ферменты обладают высокой специфичностью, т.е. действие каждого фермента строго ограничено одним субстратом или несколькими, родственными по структуре. Благодаря этому они ускоряют определенные реакции, не влияя на скорость других.

В отличие от других катализаторов, ферменты работают в мягких условиях – при низкой (близкой к комнатной) температуре и атмосферном давлении, в почти нейтральных водных растворах. Ферменты проявляют исключительно высокую ферментную активность, подчас превосходящую активность катализаторов небиологического происхождения в 10¹⁰ – 10¹⁵ раз. Ферменты обладают непревзойденной избирательностью, специфичностью действия – катализируемые ими реакции не сопровождаются образованием побочных продуктов.

3. Особенности получения ферментов.

Поскольку ферменты представляют собой макромолекулы, активность которых зависит от их первичной структуры, т.е. от последовательности аминокислот, крупномасштабный химический синтез не всегда возможен и желателен. Поэтому ферменты экстрагируют из животных и растительных клеток или производят при помощи микроорганизмов.

Промышленное производство ферментных препаратов осуществляют в настоящее время в основном из культур микроорганизмов: плесневых грибов, бактерий, дрожжей, актиномицетов.

Необходимо отметить, что по количеству, разнообразию и активности ферментов высшие растения и животные не могут конкурировать с микроорганизмами. По-видимому, у микроорганизмов ферменты возникают в результате приспособления их к различным условиям внешней среды. Так, например, микроорганизмы почвы могут непосредственно ассимилировать атмосферный азот и, следовательно, у них имеется соответствующая ферментная система. Ни животные, ни растения способностью к биологической фиксации азота не обладают.

Микроорганизмы очень быстро размножаются. У некоторых из них деление происходит каждый час или даже десятки минут. В результате из небольшого исходного количества бактерий можно получить значительную биомассу. Такие темпы совершенно недостижимы для растений и животных.

Кроме того, микроорганизмы способны продуцировать большое количество ферментов также благодаря специфическим способностям их ферментативного аппарата и высокой способности к адаптации в различных условиях окружающей среды.

Для подбора оптимального штамма микроорганизмов – продуцента данного фермента – используются такие приемы, как селекция, подбор условий культивирования и получение мутантов. Очень большие надежды возлагают на методы генетической инженерии.

Каждый микроорганизм содержит большой набор ферментов. Поэтому один и тот же вид можно использовать как продуцент различных ферментов. Один из приемов – индукция биосинтеза ферментов – позволяет значительно увеличить продукцию того или иного фермента данным видом микроорганизмов. Суть его в том, что при введении в питательную среду определенных веществ – индукторов (часто это специфические субстраты получаемых ферментов) изменяются метаболические пути в клетке таким образом, что преимущественно начинает синтезироваться данный фермент. В наиболее благоприятных случаях удается получать клетки, содержащие десятки процентов требуемого фермента от общего количества белка.

Многие микроорганизмы способны расти на простых питательных средах. В качестве источника углерода они могут использовать углеводы, спирты, кислоты, углеводороды, в частности, отходы различных производств, в частности, отходы пищевой промышленности (пшеничные и рисовые отруби, картофельную мезгу, пшеничную шелуху, подсолнечную лузгу и т.п.). Остальными компонентами питательных сред могут быть неорганические соли: фосфаты (источник фосфора), соли аммония (источник азота), соли калия, магния, железа.

К недостаткам микробного сырья следует отнести большой объем работы, предшествующий препаративному выделению ферментов (отбор, выращивание и введение штаммов-продуцентов, подготовка питательных сред, соблюдение условий стерилизации, выращивания, сушки и т.д.).

3. Биотехнологическое получение ферментативных препаратов.

Биотехнологический процесс включает большую подготовительную работу: очистку и стерилизацию воздуха, посуды и аппаратов; подготовку питательной среды для биосинтеза и ее стерилизацию; выращивание посевного материала исходной культуры. Засев производственной питательной среды и выращивание микроорганизмов (продуцентов ферментов) производят ферментере. Культивирование микроорганизмов осуществляют в основном глубинным способом в жидкой питательной среде при строго определенном значении рН, времени и температуры, подавая стерильный воздух.

1. Стадии биотехнологического процесса получения ферментов.

1. Приготовление и стерилизация питательной среды.

Для приготовления питательных сред в микробиологической промышленности используют сырье минерального, животного и растительного происхождения, а также синтезированное химическим путем. Вещества, входящие в состав питательной среды, обеспечивающие развитие культуры и биосинтез определяемых продуктов, не должны содержать вредных примесей.

При выборе сырья необходимо учитывать его себестоимость, т.к. в микробиологическом синтезе важное значение имеет стоимость исходных веществ и материалов.

Питательные среды готовят в специальных реакторах с мешалками. Среду готовят в сырьевом или рецептурном цехе по периодическому или непрерывному методу, а в отдельных случаях приготовление и стерилизацию осуществляют в ферментере.

На современных заводах применяют непрерывный метод приготовления. Для этого используют 2 резервуара: в один вводят исходные вещества, а из другого жидкость идет в смеситель непрерывного действия, а затем при помощи насоса подается в колонну для стерилизации, наряду с которой используются паровые инжекторы, или теплообменник и труба в трубе.

При работе с вертикально установленной стерилизационной колонной питательную среду подводят снизу в пространство между трубами. В верхнюю часть колонны вводят пар под давлением 0,3 – 0,4 МПа.

Если для стерилизации сред применяют относительно высокую температуру (135 С и более) и объем выдерживания не превышает нескольких десятков литров, вместо резервуаров используют систему вертикально закрепленных труб.

Теплообменники пластинчатого типа используют для нагрева и охлаждения среды, процесс стерилизации в них легко автоматизируется.

Выбор аппаратуры, технологии приготовления и стерилизации среды зависит от количества и вида компонентов, которые предварительно растворяют в подогретой или горячей воде. Если по степени растворимости и стерилизации это возможно, то все компоненты растворяют в одном растворе и в определенной последовательности. В противном случае их растворяют по группам исходных веществ, исходя из физико-химических свойств, стерилизуют и соединяют в смесителе. Если среду стерилизуют в небольших количествах, весь объем среды доводят до 120 С непосредственно в ферментере или специальных котлах стерилизаторах, выдерживают 30 – 60 мин. (в зависимости от объема среды и ее состава) при 120 С, а затем охлаждают до 27 – 30 С.

2. Приготовление посевного материала.

Штаммы-продуценты микробиологические предприятия получают из академий и университетов в пробирках на скошенном агаре или в ампулах. Каждая культура имеет паспорт с подробным описанием морфологии, характеристики среды для культивирования и хранения.

Перед началом технологического процесса культуру размножают в стерильных условиях на оптимальном составе среды и соблюдении режима выращивания (рН, температура, длительность). С поверхности скошенного агара её стерильно переносят в колбу объемом 100 – 200 мл и инкубируют в термостате. Длительность каждой стадии выращивания 24 ч.

Дальнейшее размножение посевного материала проводят в 2 этапа: в цехе чистой культуры и в отделе инокуляции. Аппараты первого этапа выращивания обычно называют инокуляторами, второго – посевными ферментерами.

3. Ферментация.

В настоящее время различают 2 способа ферментации, применяющихся в биотехнологии ферментов: глубинный и поверхностный процессы.

а) глубинная ферментация: может быть гомогенно или гетерогенно непрерывной. При гомогенном непрерывном процессе в аппарате, где идет интенсивное перемешивание, все параметры постоянны во времени. При гетерогенном непрерывном процессе несколько ферментеров соединены вместе. Питательная среда поступает в первый аппарат, готовая культурная жидкость вытекает из последнего.

При непрерывном культивировании микроорганизмов необходимо отрегулировать скорости притока питательной среды и оттока культуральной жидкости, чтобы предотвратить вымывание культуры из системы, т.е. обеспечить постоянную концентрацию клеток. В стерильных условиях непрерывный метод обеспечивает сохранение культуры в физиологически активном состоянии длительного времени.

Непрерывный процесс можно использовать в том случае, если культура при длительном выращивании не теряет способности к синтезу.

б) поверхностная ферментация: культивирование на поверхности твердой среды обычно осуществляют в увлажненной твердой, сыпучей или пастообразной среде с влажностью 30 – 80 %. Если субстрат сыпучий, то его твердые частицы хорошо контактируют с воздухом, следовательно, рост микроорганизмов происходит в этом случае на поверхности твердых частиц, а также в порах, заполненных водой или воздухом. Обеспечение микроорганизмов кислородом затрудняется с увлажнением слоя субстрата. Перемешивание слоя не допускается, если культивируются мицелляльные микроорганизмы. Другая проблема при данном способе ферментации – отвод тепла и поддержание постоянной температуры во всей среде.

Ферментеры.

В микробиологическом производстве применяют разнообразные ферментеры, которые условно можно подразделить на следующие группы: барботажные, эрлифтные, барботажно-эрлифтные, с механическим перемешиванием, барботажные с циркуляционным перемешиванием, с эжекционной системой и т.п.

По структуре потоков ферментеры могут быть аппаратами полного перемешивания или полного вытеснения.

По способу ввода энергии и аэрации различают аппараты с вводом энергии в газовую фазу, в жидкую фазу или комбинированные.

Объем производственных ферментеров может быть от 10 до 1000 м³ с механическим перемешиванием и барботажем. Ферментеры представляют собой герметические цилиндрические емкости, высота которых в 2 – 2,5 раза превышает диаметр, как правило, их изготавливают из нержавеющей стали. В ферментерах устанавливают мешалки турбинного, пропеллерного и др. типов. Ферментер оборудован арматурой и трубопроводами для подачи питательной среды, воды и пара; раствора, регулирующего рН среды, пеногасителей, воздуха и др. материалов.

Современные ферментеры укомплектовывают измерительными и регулирующими приборами для пеногашения, смотровыми люками.

Главные требования к аппаратами – сохранение стерильности, поэтому они должны быть доступны для обработки горячим паром.

Рабочий объем ферментера не превышает 6/10 объема.

Для стерильной ферментации широко используют аппараты объемом 100 м³. Перед заполнением основного ферментера, его и систему трубопроводов моют водой и стерилизуют горячим паром под давлением, и затем заполняют охлажденной питательной средой.

Процесс развития микроорганизмов в ферментере происходит при строгом контроле всех стадий, точном выполнении регламента, условий развития продуцента фермента. Большое внимание уделяется поддержанию заданной температуры культивирования, активной кислотности, рН среды, степени аэрации и скорости работы мешалки, потребление организмов основных питательных компонентов, контролируется образование фермента.

Ферментацию прекращают, когда в среде накапливается максимальное количество полезного продукта. По окончании процесса культуральную жидкость охлаждают до 5 – 10 С с целью обеспечения стабильности продукта и предотвращения развития посторонней микрофлоры, затем культуральную среду перекачивают в резервуары, из которых она подается на дальнейшую переработку.

4. Предварительная обработка культуральной жидкости.

В состав культуральной среды входят остатки использованной питательной среды, синтезированные метаболиты и биомасса продуцента.

Для выделения продуктов биосинтеза обычно используют сепараторы, центрифуги, фильтр-прессы, вакуум-барабанные фильтры, ротационно-вакуумные фильтры, отстойники. Выбор оборудования для данной стадии зависит от масштаба ферментации, типа клеток, свойств культуральной жидкости, места локализации ферментов.

Стадия предварительной обработки культуральной жидкости в некоторых технологиях производства ферментов включает стадию разрушения клеток и клеточных стенок с помощью гомогенизаторов высокого давления, ультразвука, химической и ферментационной обработкой.

Биомассу грибов собирают центрифугированием культуральной жидкости или сепарированием, а бактериальные клетки требуют предварительной обработки культуральной жидкости путем флоккуляции в более крупные образования с целью повышения эффективности разделения в центрифуге. После предварительной обработки культуральную жидкость центрифугируют или декантируют. Альтернативой центрифугированию служит фильтрование (для небольших объемов культуральной жидкости – нутч-, друк-фильтры, вакуум-барабанные фильтры, ротационно-вакуумные фильтры, для больших объемов – пресс-фильтры).

4. Выделение и очистка фермента.

Стадия выделения и химической очистки включает ряд процессов: от обработки нативного раствора до сушки готового продукта. После центрифугирования биомассу получают в виде густой жидкости или пасты. Клеточную массу промывают, фильтруют, сушат, гидролизуют, экстрагируют из нее фермент. Если фермент находится в растворе, биомассу после отделения применяют как побочный продукт, а нужное вещество выделяют из раствора осаждением, фильтрацией, экстракцией и др.

Для получения высокоочищенного фермента применяют высаливание, диализ, электродиализ, мембранную фильтрацию, гель-фильтрацию, ионообменную и аффинную хроматографию и сорбционные методы.

Концентрирование растворов, содержащих ферменты, осуществляют лиофилизацией, вакуум-выпариваниием, вымораживанием.

Приведем характеристику основных методов очистки ферментов.

Одним из прогрессивных методов очистки является ультрафильтрация, позволяющая проводить разделение в соответствии с размером молекул или молекулярной массой веществ. Ультрафильтрация – это мембранный метод разделения, осуществляемый с помощью полупроницаемых мембран. Этот метод применяют для разделения растворов и коллоидных систем, в которых молекулярная масса растворенных компонентов намного больше молекулярной массы растворителя. Движущая сила процесса ультрафильтрации характеризуется соотношением вида:

Р=р-(П₁-П₂),

где р – давление над исходным раствором;

П₁, П₂ – осмотическое давление раствора и фильтрата.

Наличие широкого набора мембран позволяет отделять различные примеси, очищать, концентрировать, обессоливать целевой продукт.

Преимущества метода: исключается денатурация белка, т.к. процесс идет без фазовых превращений при любой температуре; возможно одновременное концентрирование и очистка от минеральных и низкомолекулярных органических веществ; незначительные затраты энергии; простота устройства и эксплуатации ультрафильтрационных установок.

Недостатком ультрафильтрации является эмпирический подход к подбору мембран.

Технология ультрафильтрации.

Суспензию под давлением пропускают через полупроницаемую мембрану с большим количеством пор мельчайшего диаметра, в результате чего коллоидные частицы задерживаются мембраной, а жидкость проходит сквозь стенки нитей и скапливается в корпусе патрона.

Основные виды ультрафильтрационных установок:

1. плоскокамерные многосекционные аппараты типа фильтр-пресс:

В этих аппаратах разделительный мембранный элемент состоит из двух плоских мембран, между которыми расположен пористый дренажный материал. Элементы располагаются на небольшом расстоянии друг от друга, в результате чего между ними образуются межмембранные каналы, по которым разделяемая смесь циркулирует и после концентрации выводится из аппарата. Прошедший через мембрану фильтрат отводится по дренажному материалу в коллектор. Для турбулизации потока раствора между элементами устанавливают сетку-сепаратор.

2. ультрафильтрационная установка с трубчатыми фильтрующими элементами:

Трубчатые мембранные аппараты состоят из набора, изготовленных из пористого материала дренажных трубок. Материал, образующий мембрану, наносится на внутреннюю или внешнюю поверхность трубок, в соответствии, с чем разделяемая смесь подается в трубное и межтрубное пространство.

3. ультрафильтрационная установка с рулонной укладкой мембран.

4. ультрафильрационные аппараты с мембранами в виде полых волокон:

В данных аппаратах с мембранной в виде полого волокна мембранный элемент представляет собой цилиндр, в который помещен пучок полых волокон.

Важную роль в технологии выделения и очистки ферментов играют хроматографические методы.

Они включают гель–фильтрацию (или эксклюзивную хроматографию), когда время выхода вещества из хроматографической колонки зависит от размера его молекул или молекулярной массы (более крупные молекулы не входят в поры сорбента и элюируются раньше). Эксклюзивная хроматография осуществляется в жидкостных хроматографах. Колонки наполняют сорбентами – мягкими (сефадексы и декстрановые гели), полужесткими (полиакриламидные гели) или жесткими (пористые стекла), чаще всего на практике используют гель – фильтрацию через сефадекс. Сефадекс представляет собой полисахарид декстран, цепи которого соединены поперечными связями, образуя «молекулярное сито». Чем больше поперечных сшивок, тем меньше размер ячеек «молекулярного сита». Молекулы небольших размеров диффундируют внутрь набухших гранул, а крупные белковые молекулы проходят сквозь колонку. Детектором при осуществлении эксклюзивной хроматографии служит обычно проточный рефрактометр или спектрофотометр. Следует отметить, что при гель-фильтрации может происходить и частичное фракционирование белков.

Ионообменная хроматография – один из самых широко применяемых методов разделения и очистки белков, благодаря высокой способности сорбентов связывать белок и возможности использования различных етодов элюации (непрерывной и ступенчатой); это разделение, основанное на различиях в суммарных зарядах присутствующих веществ при данном значении рН (вещества, имеющие большой заряд, удерживаются сильнее и элюируются позже). При ионообменной хроматографии в неводных средах применяют иониты с жесткой матрицей – макропористые ионообменные смолы. В зависимости от сродства к фиксированным ионам неподвижной фазы разделяемые ионы перемещаются вдоль хроматографической колонки с различными скоростями; чем выше сродство, тем больше объем удерживаемого компонента. При разделении органических веществ детектором служит обычно проточный ультрафиолетовый фотометр. Ионообменная хроматография применяется для разделения белков, ферментов и т.п. Их разделяют с помощью агарозных и декстрановых гелей, а также с помощью производных целлюлозы. Так, например, для ионообменной хроматографии ферментов наиболее широкое применение в качестве носителей нашли карбоксиметилцеллюлоза и диэтиламиноэтилцеллюлоза. При проведении ионообменной хроматографии необходимо учитывать, что при определенных значениях рН раствора и концентрации электролитов возможна инактивация ферментов.

Обращенно–фазовая или гидрофобная хроматография основана на то, что гидрофобные вещества сильнее связываются с поверхностью сорбента и элюируются позже. В основе механизма селективности при гидрофобной хроматографии лежит проявление гидрофобного эффекта, а также модуляция электровалентных взаимодействий, вследствие понижения локальной диэлектрической постоянной среды при введении неполярных радикалов или понижения активности растворителя. При проведении гидрофобной технологии следует учитывать физико-химические параметры сорбентов: пористость, удельную поверхность, гидрофильные и гидрофобные свойства, химическую стабильность, инертность, проницаемость. Использование гидрофобной хроматографии удобно и при работе с высококонцентрированными растворами.

Перспективной для выделения и очистки ферментов является аффинная хроматография, разделение с помощью, которой основано на том, что один из компонентов смеси обладает повышенной способностью к связыванию с лигандом, присоединенным ковалентной связью к инертному носителю. При пропускании смеси белков или культуральной жидкости через колонку молекулы соединения, обладающего сродством к лиганду, удерживаются в колонке, в то время как другие выходят из нее. Вещество из колонки селективно элюируют с помощью буфера, содержащего лиганд или его аналог, иногда с добавлением растворителя. В качестве лигандов при аффинной хроматографии используются соединения, взаимодействие которых с разделяемыми соединениями основано на биологической функции последних. Например, при разделении ферментов лигандами служат ингибиторы, кофакторы, субстраты, при выделении антител и антигенов – соответственно иммобилизованные антигены и антитела (иммуносорбция). В качестве носителей используют силикаты, полиакриламидные гели, декстраны, целлюлозу, агарозу и др. Такие природные нерастворимые в воде полимеры, как хитин и крахмал, одновременно могут служить носителями и субстратами для ряда ферментов.

Разделяемую смесь помещают в сосуд с сорбентом и выдерживают определенное время или пропускают с определенной скоростью через колонку, наполненную сорбентом, до полного связывания исследуемого компонента. Затем сорбент многократно промывают буферным раствором для удаления не связывающихся веществ, после чего элюируют исследуемый компонент новой порцией буферного раствора, содержащего лиганд, вытесняющий связанный компонент. Эффективность разделения зависит от сродства между биологически активными веществами и лигандом, стерической доступности и концентрации лиганда на носителе.

Аффинная хроматография может обеспечить полную очистку продукта из сложной многокомпонентной смеси – культуральной жидкости, в одну стадию, что не возможно с применением других методов хроматографии, которые требуют многоэтапной очистки, трудоемки и требуют больших затрат времени.

Недостаток аффинной хроматографии – это дороговизна, быстрый выход из строя колонки при пропускании через нее смесей, компоненты которых забивают промежутки между гелевыми частицами. На производстве эти колонки работают в периодическом режиме.

5. Получение готовой продукции.

После выделения и химической очистки фермента его необходимо высушить – удалить из полученного препарата свободную и связанную воду. Поскольку ферменты термолабильны, для их высушивания используют методы, не приводящиие к потере биологической активности.

На современном этапе промышленного получения ферментов используют различные методы обезвоживания препаратов. Широкое распространение получила лиофильная сушка ферментов, которая проводится при сравнительно низких температурах. Лиофилизация (сублимационная) сушка в вакууме предварительно замороженных в вакууме биологически активных веществ – один из современных методов консервирования биопрепаратов. Метод осуществляется в два приема: замораживание и высушивание, при этом влагу из замороженного состояния в препарате испаряют под вакуумом, минуя жидкую фазу. В процессе сублимации влага перемещается в препарате не в виде жидкости, а в виде пара. В результате удается в максимальной степени сохранить специфические свойства белков, свести к минимуму процессы денатурации. Лиофилизированные биопрепараты сохраняют почти все свои первоначальные свойства и объем, легко растворяются в воде, быстро приобретая исходные качества и внешний вид.

При работе с большим количеством раствора, содержащим ферменты, проводят высушивание с применением распылительных сушилок.

Одной из важных операций химической очистки ферментов является кристаллизация. В зависимости от химического строения фермента и его физико-химических свойств применяют следующие методы кристаллизации: выпаривание растворителя (изотермический), охлаждение горячего раствора (изогидрический), одновременное охлаждение и выпаривание (комбинированный), добавление в раствор других веществ, снижающих растворимость (высаливание), вымораживание.

После высушивания препарат, в случае его нестойкости, необходимо смешивать со стабилизатором или с наполнителем (крахмал, декстрины, неорганические нейтральные соединения, тальк и др.).

Так как, ферменты являются очень лабильными, легко инактивируемыми соединениями, то именно этим и объясняется специфичность методов выделения и очистки ферментов. Все операции по выделению и очистки ферментов проводят в условиях, исключающих возможность денатурации. Эти условия – низкая температура, строгое ограничение продолжительности операций, контроль за рН, отсутствие примесей солей тяжелых металлов и других соединений, которые могут привести к денатурации фермента.

3. Оценка качества выделенного и очищенного фермента.

Оценка качества выделенного и очищенного фермента осуществляется с помощью определения гомогенности, а также активности фермента. О гомогенности фермента судят на основании сопоставления данных по фракционированию фермента различными методами (ультрацентрифугированием, хроматографией, гель-фильтрацией, электрофорезом). Гомогенность фермента должна быть подтверждена несколькими методами, основанных на различных принципах, т.к. в некоторых случаях ферменты, ведущие себя как гомогенные белки при центрифугировании, могут быть разделены методом электрофореза на колонках из крахмала на несколько изоферментов.

По мере очистки активность фермента возрастает и достигает определенного максимального значения, характерного для однородного фермента. Постоянство активности при перекристаллизации также является критерием гомогенности фермента.

Рассмотрим основные методы определения активности фермента.

Характеристикой активности фермента является скорость, с которой он катализирует ту или иную реакцию, измеряемая скоростью превращения субстрата или скоростью накопления продуктов реакции. При определении активности ферментов следует измерять начальную скорость превращения, а не количество субстрата, превращенное за определенный отрезок времени. При этом количество субстрата, превращенное ферментом, надо относить к количеству фермента.

Для определения активности ферментов применяются различные методы:

1. Химический метод – количественное определение субстрата или продуктов, образующихся в результате ферментативных реакций с помощью различных химических реагентов.

2. Спектрофотометрический метод – измерение скорости ферментативной реакции по изменению поглощения субстрата или продукта реакции при характеристической длине волн. Этот метод нашел широкое применение для определения активности оксиредуктаз.

3. Манометрический метод – определение количества газа, выделившегося в результате ферментативной реакции. Данный метод (метод Варбурга) используется, например, для определения активности оксидаз (по поглощению кислорода) или декарбоксилаз (по выделению углекислого газа) и целого ряда других ферментов.

4. Поляриметрический метод – фиксируется изменение оптического вращения при протекании ферментативной реакции.

5. Хроматографический метод – количественное определение субстрата или продуктов ферментативной реакции с помощью различных видов хроматографии.

При установлении степени очистки ферментного препарата необходимо рассчитать удельную активность фермента, характеризующую содержание фермента в исследуемом материале.

Под удельной активностью понимают число единиц активности на единицу веса сухого препарата; она выражается числом единиц на 1 мг белка. Концентрация фермента в растворе выражается числом единиц активности на 1 мл.

Активность ферментов поддается регулированию в широких пределах направленным изменением условий среды, ее кислотности, добавками веществ, активирующих или подавляющих фермент.