7. Использование культуры растительных тканей для получения стероидных соединений.

На основе культур растительных тканей было выделено более 50 различных стероидных соединений: -ситостерин, стигмастерин, диосгенин, холестерин, тигогенин, гитогенин, 24-метиленхолестерин и другие.

Виды диоскореи интенсивно изучаются в культуре ткани в качестве возможных продуцентов стероидных сапонинов. Диосгенин, представляющий интерес в качестве исходного вещества для производства гормональных препаратов, выделен из культур тканей видов Dioscorea, D. deltoidea, D. tokoro, D. composita, D. floribunda, Solanum xanthocarpum, S. laciniatum и другие. Содержание диосгенина в культурах тканей в зависимости от происхождения и условий культивирования растений различно: 1,33 % в культурах клубневого происхождения D. floribunda; 3,8 % в культуре ткани D. Deltoidea, росшей в хемостате.

В настоящее время наметился переход к промышленным способам культивирования тканей D. Deltoidea. Скорость роста культуры D. deltoidea в ферментере достигла 0,55 г/л в день, максимальная продуктивность по содержанию диосгенина – 12 мг на 1 л культуральной среды за один день в случае двухстадийного процесса (7,8 % от массы сухой ткани).

В сумме сапонины, выделенные из каллусных тканей D. deltoidea, обладали фармакологической активностью, аналогичной активности стероидных сапонинов из интактного растения.

Работы ученых с культурами тканей, продуцирующими стероидные соединения, внесли большой вклад в изучение биосинтеза этих соединений. Используя меченые предшественники (¹⁴С-ацетат, ¹⁴С-мевалоновую кислоту, ¹⁴С-2,3-оксидосквален, 4-¹⁴С-холестерин и другие соединения) было установлено, что ключевым предшественником сапонинов является циклоартенол, а также то, что гидроксилированию кольца А в биосинтезе йоногенина и токорогенина предшествует гидроксилирование боковой цепочки холестерина.

В результате комплекса таких исследований предложена следующая последовательность биосинтеза стероидных сапонинов: мевалонат–циклоартенол–холестерин–3, 16, 26–тригидроксихолест–5–ен–3, 16, 22, 26–тетрагидроксихолест–5–ен–диосгенин (йоногенин) – токорогенин.

Задание 2. Выполнить лабораторную работу.

Вариант 1. Биотрансформация лекарственных веществ в организме.

1. Качественная реакция на дезоксикортикостерон-ацетат (лекарственный препарат).

Принцип метода. Реакция основана на взаимодействии дезокортикостерон-ацетата с серной кислотой с образованием продукта с образованием продукта синего цвета с красной флюоресценцией.

Техника выполнения работы. К 1 капле дезоксикортикостерон-ацетата добавить 4 – 5 капель 96 % спирта и 4 – 5 капель раствора концентрированной серной кислоты. Нагреть до закипания. Появляется синее окрашивание.

2. Обнаружение 17-кетостероидов в моче (продуктов окисления стероидных гормонов).

Принцип метода. Метод основан на взаимодействии 17-кортикостероидов с м-динитробензолом в щелочной среде с образованием продуктов конденсации розово-фиолетового цвета.

Техника выполнения работы. К 4 – 5 каплям мочи добавить 4 – 5 капель 2 % раствора м-динитробензола в спирте и 2 – 3 капли концентрированного раствора гидроксида калия. Появляется розово-фиолетовое окрашивание.

Вариант 2. Биотрансформация органических субстратов ферментативными системами культивируемых тканей растений.

Целью проводимого исследования является:

1. Ознакомление с основными типами реакций биотрансформации, катализируемых монооксигеназными системами животных, растительных и микробных клеток.

2. Освоение метода определения n-анилингидроксилазной активности культуры ткани женьшеня.

Принцип метода. Метод определения n-анилингидроксилазной активности основан на определении образующегося n-аминофенола. Реакция протекает на молекуле цитохрома Р-450 только в присутствии молекулярного кислорода и НАДФН⁺, являющихся необходимыми кофакторами процесса микросомального окисления.

n-аминофенол реагирует с фенолом и в присутствии карбоната натрия образует окрашенный в синий цвет индофенольный комплекс.

Практическая значимость работы.

1. На примере n-гидроксилирования анилина показано, что культуры тканей растений могут быть использованы не только в биосинтезе вторичных метаболитов de novo, но и для биотрансформации химических соединений.

2. Способность культивируемых тканей растений может быть использована в биотехнологических синтезах фармацевтических препаратов (стероидов, алкалоидов, гликозидов и других).

3. Путем селекции или с помощью методов генетической инженерии можно создавать линии клеток с более высокой трансформирующей способностью.

Техника выполнения работы. Навеску ткани (1,0 г) тщательно растирают в ступке с 1 мл буфера с целью гомогенизации. Гомогенат центрифугируют при 15000 об/мин. Надосадочная жидкость представляет собой экстракт ткани, свободный от митохондрий, ядер и обломков клеток.

Схема проведения опыта.

Вариант	Состав инкубационной смеси, мл
	0,04 М трис-HCl буфер, рН 7,4	0,16 М MgCl2	0,03 М НАДФН^+	Экстракт культуры ткани	0,03 М анилин
Опыт	1,5	0,1	0,1	0,2	0,1
Контроль	1,6	0,1		0,2	0,1

Инкубацию проводят при 37 С в течение 15 минут. Реакцию останавливают добавлением 1 мл 10 % раствора ТХУ. После осаждения белков смесь фильтруют, отбирают 1 мл фильтрата и определяют содержание в нем n-аминофенола путем добавления 0,5 мл 10 % раствора карбоната натрия и 1,5 мл 2 % фенола в 0,2 М растворе гидроксида натрия. Для развития окраски пробы выдерживают на водяной бане при 37 С в течение 10 минут. Оптическую плотность опытной пробы против контрольной измеряют на фотоэлектроколориметре в кювете 10 мм при 670 нм.

Величину n-анилингидроксилазной активности рассчитывают по формуле:

С*1,5*30 ,

г ткани

где С – концентрация n-аминофенола, найденная по калибровочному графику;

1,5 – расчетный коэффициент численно равный объему экстракта, полученному из 1,0 г ткани;

30 – разведение пробы.

Литература:

1. Биологическая химия: Руководство к лабораторным занятиям/ Сост. В.П. Комов, В.Н. Шведова, Н.В. Кириллова, О.М. Спасенкова, В.И. Фирсова, Л.А. Троицкая. – СПб.: СПХФА. – 1998.

2. Биотехнология в 8-ми томах/ Под ред. Егорова Н.С., Самуилова В.Д. – М.: Высш.шк. – 1988.

3. Биотехнология: принципы и применения/ Под ред. Хиггинса И., Беста Д., Джонса Дж. – М.: Мир. – 1988.

4. К практическим занятиям по биологической химии: Методические указания/ Под ред. В.И. Закревского. – Волгоград: ВМА. – 1999.

5. Лекционный материал по биотехнологии.

6. Микробиология продуцентов биологически активных соединений: Методические указания к лабораторным занятиям/ Сост. С.В. Гурина, Т.С. Потехина, Н.Н. Елинова. – СПб.: СПХФА. – 1997.

7. Николаева Л.А. Культура тканей лекарственных растений и ее биотехнологическое использование: Текст лекций. – СПб.: СПХФИ. – 1992.

8. Сассон А. Биотехнология: свершения и надежды/ Пер. с англ. Мехедова С.Л., Миркина С.М. – М.: Мир. – 1987.

9. Сельскохозяйственная биотехнология: Учеб./ Под ред. В.С. Шевелухи. – М.: Высш. шк. – 1988. – 416 с.

10. Словарь по биотехнологии/ Симонян А.В., Покровская Ю.С. – Волгоград. – 2002.

Темы рефератов.

1. Проблемы биотрансформации стероидных структур.

2. Структура промышленного биотехнологического производства стероидных гормонов.

3. Подходы к решению проблемы селективности процессов биоконверсии.

4. Микробиологический синтез гидрокортизона.

5. Получение стероидных соединений на основе культур растительныхклеток.

6. Перспективы осуществления процессов биоконверсии стероидных соединений с применением технологии иммобилизованных ферментов.