Классификация индукторов интерферона, пригодных для клинического использования.

Химическая природа	Препарат
А. Синтетические соединения
- Низкомолекулярные (ароматические углеводы): флуореноны, акриданоны	Амиксин, Циклоферон, Неовир
- Полимеры	Полудан, Полигуацил, Ампилиген
Б. Природные соединения
- Низкомолекулярные: полифенолы (производные госсипола)	Мегасин, Кагоцел, Саврац, Рогасин
- Полимеры: двуспиральные РНК	Ларифан, Ридостин

В настоящее время есть все основания полагать, что в недалеком будущем область клинического применения индукторов интерферонов будет значительно расширена, и эти препараты смогут, подобно интерферонам, использоваться при ОРВИ, герпесе, вирусных гепатитах, ВИЧ-инфекции, энцефалитах, бешенстве, а также для предупреждения вторичных вирусных осложнений, возникающих в результате применения цитостатиков и иммунодепрессантов.

Индукторы интерферона относятся к новому поколению лекарств. Применение этих препаратов имеет ряд преимуществ перед рекомбинантными интерферонами:

• Индукторы интерферонов не обладают антигенностью.

• Естественный (но стимулированный) синтез эндогенного интерферона не вызывает гиперинтерферонемии, которая нередко возникает при использовании рекомбинантных интерферонов и приводит к тяжелым побочным явлениям.

• Однократное введение индукторов интерферона обеспечивает длительную циркуляцию интерферона на терапевтическом уровне. Для достижения такого уровня экзогенных интерферонов требуется многократное введение высоких доз рекомбинантных интерферонов. Некоторые индукторы интерферона обладают уникальной способностью запускать синтез интерферона в определенных популяциях клеток, что имеет существенные преимущества перед поликлональной стимуляцией иммуноцитов рекомбинантными интерферонами.

• Индукторы интерферона обладают иммуномодулирующими свойствами и сочетаются не только с рекомбинантными интерферонами, но и с другими противовирусными препаратами, вызывая при этом синергидный эффект при сочетанном применении.

• Широко применяемые рекомбинантные интерфероны являются препаратами α-интерферона, что значительно ограничивает их противовирусные свойства, т.к. для эффективной противовирусной защиты необходимо наличие всех трех классов интерферонов, синтез которых и вызывается применением индукторов интерфероногенеза.

Гормон роста.

Гормон роста (соматотропный гормон) – белок, секретируемый передней долей гипофиза позвоночных животных. Наличие его в экстрактах из гипофиза было отмечено в 1921 гг. Эвансом и Дж. Лонгом, но лишь через два десятилетия в 1944 г. он был получен в виде очищенного препарата, а в 1948 г. – в кристаллическом виде.

В гипофизе человека содержится от 3,7 до 6 мкг гормона роста, он представлен одной полипептидной цепочкой из 191 аминокислотного остатка

Гормон роста обладает ярко выраженным анаболическим действием и влияет на все клетки организма, повышая в них уровень биосинтетических процессов, усиливает биосинтез белков, ДНК, РНК и гликогена, способствует мобилизации жиров из жировых депо и ускоряет распад высших жирных кислот и глюкозы. Соматотропный гормон улучшает функции почечных канальцев и нормализует минеральный и водный обмен организма, что способствует росту организма, но, в конечном счете, действие гормона гораздо шире, нежели только регуляция роста. Исследования на молекулярном уровне показали, что СТГ стимулирует действие РНК-полимераз и полирибосомного аппарата клетки. Как свидетельствуют опыты с меченым фосфором, самым ранним эффектом действия гормона роста является синтез в ядрах клеток предшественников мРНК и рРНК. Вместе с тем велико его влияние и на проницаемость клеточных стенок, т.к. фонд внутриклеточных аминокислот в присутствии СТГ значительно возрастает, что способствует новообразованию белка. СТГ повышает содержание в крови особых стимулирующих рост факторов – соматомединов.

Гормон роста человека, синтезированный в специально сконструированных клетках бактерий, имеет очевидные преимущества: доступен в больших количествах, его препараты являются биохимически чистыми и свободными от вирусных загрязнений. Биосинтез соматотропина был осуществлен Гедделем с сотрудниками Поскольку при синтезе ДНК на мРНК гормона с последующим превращением ее в двухнитиевую форму получается ген, кодирующий предшественник соматотропина, который расщепляется в бактериальных клетках с образованием активного гормона, исследователи избрали следующий подход. На первом этапе клонировали двухнитиевую ДНК-копию мРНК и расщеплением рестрикционными эндонуклеазами получили последовательность, которая кодирует всю аминокислотную последовательность гормона, за исключением первых 23 аминокислот. Затем клонировали синтетический полинуклеотид, соответствующий аминокислотам от 1-й до 23-й и, наконец, два полученных фрагмента объединили вместе, и «подстроили» к паре промоторов и участку связывания рибосом. Конечный выход гормона составил 2,4 мкг на 1 мл культуры или 1 % от растворенных белковых клеток этого генетически сконструированного штамма E.coli.

Синтезированный в бактериях гормон обладал нужной молекулярной массой и не был связан с каким-либо бактериальным белком, от которого его необходимо было бы отщепить. Однако синтетический гормон содержал на N-конце полипептидной цепи дополнительный остаток метионина. Эта лишняя аминокислота удалялась при длительном выращивании кишечной палочки. В июне 1978 г. исследователи компании «Генентек» представили данные, доказывающие, что соматотропин с дополнительным остатком метионина, синтезированный в генетически сконструированных клетках бактерий, обладает биологической активностью нативного гормона. Они провели сравнение стимуляции роста крыс с удаленным гипофизом гормоном роста, синтезированным в клетках бактерий, и препаратом, полученным из гипофиза человека. Прирост массы и рост больших берцовых костей был одинаковым как для обоих препаратов, так и для их смеси.

Инсулин.

Инсулин (от гист. Insulae pancreaticae – панкреатические островки) – белковопептидный гормон, синтезируемый в β-клетках островков поджелудочной железы; является универсальным анаболическим гормоном, необходимым для роста и развития организма, подобно соматотропному гормону гипофиза, синергистом которого в этом отношении он является. Одним из наиболее ярких эффектов инсулина служит его гипогликемическое действие.

Инсулин – один из наиболее полно изученных гормонов поджелудочной железы. Действие этого гормона связано с регуляцией содержания сахара в крови. Считают, что инсулин осуществляет вспомогательную функцию при переносе глюкозы из крови через стенки сосудов к мускульной ткани, где глюкоза расходуется для энергетических целей, или к клеткам печени, где из глюкозы синтезируется резервный полисахарид – гликоген. Предполагают, что инсулин способствует удалению глюкозы из крови в результате его специфической ориентации на поверхности клеточной оболочки, что облегчает проникновение через нее глюкозы из крови. При недостатке инсулина концентрация глюкозы в крови начинает повышаться, т.к. глюкоза не может свободно диффундировать внутрь клеток. В последнее время считают, что инсулину принадлежит важная роль в регуляции биосинтеза глюкозы в организме.

Структура инсулина была установлена Сенджером. Это циклический гетерогенный пептид, состоящий из двух цепей, соединенных двумя сульфидными мостиками. В одной из цепей, кроме того, имеется внутренний дисульфидный мостик. В цепи А содержится 21, а в цепи В – 30 аминокислотных остатков.

Со времени проведения первых опытов по использованию инсулина для лечения диабета в 1922 г. этот гормон выделяли из поджелудочной железы животных (коров и свиней).

Существует несколько причин, по которым целесообразна разработка методов крупномасштабного производства и выпуск на рынок инсулина человека: среди них коммерческие соображения и эмоциональные факторы, и потребности развития науки, и возможные преимущества при лечении.

Инсулин, как коров, так и свиней немного отличается по аминокислотной последовательности от инсулина человека. Особенно близки инсулины человека и свиньи: у последнего лишь С-концевой треонин В-цепи заменен на аланин. Инсулины коровы и человека различаются по трем аминокислотным остаткам, и именно этими различиями определяется повышенная иммуногенная активность инсулина коровы по сравнению с инсулином свиньи. Почти у всех больных, которых лечат обычным методом, т.е. вводят им инсулин коровы, в крови появляются антитела к инсулину. Антигенные свойства инсулина частично определяются примесями в его препаратах. Скорее всего, именно образованием антител к инсулину объясняются некоторые незначительные побочные эффекты при инъекциях инсулина коровы, например, атрофия подкожной жировой прослойки. В случае высокоочищенного инсулина свиньи эти эффекты отсутствуют. Далее антитела к инсулину инактивируют его в кровотоке, так что больному приходится вводить большие дозы, чем это необходимо. Антитела влияют и на продолжительность биологического действия введенного инсулина. Можно предположить, что инсулин человека будет еще менее иммуногенным, чем инсулин свиньи.

Так как число больных диабетом и соответственно потребность в инсулине растут, то вполне возможно, что доступность его в будущем уменьшится из-за нехватки исходного сырья – поджелудочной железы животных. Из-за чисто эмоциональных факторов лучше использовать инсулин человека, чем какого-либо животного.

Ряд производителей инсулина во главе с фирмой «Eli Lilly and Co» использовали как основу для производства инсулина человека технологию рекомбинантных ДНК. Согласно схеме процесса, разработанного «Eli Lilly» в сотрудничестве с фирмой «Genenetech Inc.», на первом этапе воссоздают последовательность ДНК по аминокислотной последовательности инсулина, раздельно синтезируя искусственные гены его А- и В-цепей. На 5΄-конце каждого из них располагается кодон метионина (который в синтезированном белке оказывается N-концевым), а на 3΄-конце – терминирующие последовательности. Каждый из генов встраивается затем в ген β-галактозидазы плазмид, а их в свою очередь вводят в клетки E.coli. Поскольку бактерии растят на среде с галактозой, то в них индуцируется синтез β-галактозидазы, а вместе с ней А- и В-цепей инсулина, присоединенных через остаток метионина. После лизиса бактерий и обработки бромцианом, который специфически расщепляет белки по остатку метионина, цепи инсулина отделяют от β-галактозидазы (инсулин метионина не содержит). Затем проводят очистку цепей и их объединение, в результате чего образуется нативный двухцепочечный инсулин. Было показано, что он не содержит белков E.coli, эндотоксинов и пирогенных веществ, по физическим свойствам неотличим от инсулина из поджелудочной железы человека и в тест- системе проявляет полную биологическую активность.

Впоследствии был испытан альтернативный метод: синтезировали ген молекулы–предшественника, проинсулина, который вводили в E.coli. После очистки проинсулина его расщепляли трипсином и β-карбоксипептидазой и получили нативный инсулин.

Инсулин человека, полученный с помощью E.coli, оказался первым «генно-инженерным белком», испытанным на людях. В опытах со здоровыми добровольцами было установлено, что он безопасен, во всяком случае при краткосрочном применении (не вызывает аллергических и иных нежелательных реакций) и обладает практически одинаковой с инсулином свиньи способностью снижать уровень глюкозы в крови при введении его под кожу и внутривенно. В настоящее время такой инсулин человека получают множество диабетиков во всем мире. Этому предшествовали клинические испытания, в ходе которых изучались изменения метаболизма и иммунологические эффекты. Сегодня это уже обычный метод лечения.

Задание 2: Выполнить лабораторную работу.

Вариант 1. Гидролиз ДНП дрожжей и обнаружение компонентов ДНП в гидролизате.

Ход работы. В широкую пробирку с воздушным холодильником поместить одну лопаточку сухих дрожжей и добавить 10 мл 10 % раствора серной кислоты. Поместить пробирку в кипящую водяную баню на 1 ч. После гидролизат охладить и провести с ним качественные реакции на составные части ДНП.

Биуретовая реакция на полипептиды. К 5 каплям гидролизата приливают 10 капель 10 % раствора едкого натра и 2 капли 1 % раствора сульфата меди. Наблюдается появление розовой или розово-фиолетовой окраски.

Серебряная проба на пуриновые основания. К 10 каплям гидролизата добавляют 10 капель раствора аммиака до щелочной реакции, затем 20 капель 2 % аммиачного раствора нитрата серебра. При стоянии через 3 – 5 мин. образуется светло-коричневый осадок серебряных солей пуриновых оснований.

Качественная реакция на пентозу (реакция Троммера). К 10 каплям исследуемого гидролизата добавляют 10 капель 10 % раствора едкого натра и 5 капель 7 % раствора сульфата меди. Осторожно нагревают верхнюю часть содержимого пробирки до закипания и кипятят в течение 1 мин. Наблюдается появление красного окрашивания.

Молибденовая проба на фосфорную кислоту. К 10 каплям гидролизата приливают 20 капель молибденового реактива и кипятят. При этом жидкость окрашивается в желто-лимонный цвет. Пробирку охлаждают в струе холодной воды. На дне пробирки появляется кристаллический лимонно-желтый осадок фосфорномолибденовокислого аммония.

Вариант 2. Изучение динамики изменения концентрации сахара в крови интактных животных (кроликов) через 30, 45, 60 мин после введения им гормона исулина.

Инсулин оказывает большое влияние на углеводный обмен, и поэтому получил название гипогликемического фактора. Главными мишенями инсулина являются клетки мышц, печени, жировой ткани. Рецепторы инсулина локализованы на поверхности клеток-мишеней и гормон проявляет свое действие, не проникая в клетку. Характер действия инсулина на углеводный метаболизм многообразен. Он повышает проницаемость клеточных мембран для глюкозы, аминокислот и некоторых других соединений. Инсулин повышает активность гексокиназы, гликогенсинтетазы, оказывая в тоже время ингибирующее действие на ферменты глюконеогенеза.

Практическая значимость. Инсулин – лекарственный препарат, который вводят с лечебной целью, главным образом, при заболевании сахарным диабетом. Вводят его только парентерально, т.к. вследствие своей белковой природы он инактивируется в желудочно-кишечном тракте под действием протеолитических ферментов. У здорового человека через 20 – 30 мин после введения инсулина уровень сахара в крови снижается до 50 % исходного, а через 40 мин начинает повышаться и к 90 – 120 мин достигает нормы или даже слегка превышает ее.

Ход работы.

1. Из ушной раковины кролика взять 0,1 мл крови с целью определения содержания сахара в крови до инъекции инсулина.

2. Исходный препарат инсулина, содержащий 40 ЕД/мл, развести в 50 раз (0,2 мл инсулина в 9,8 физиологического раствора) и ввести кролику подкожно в боковую поверхность 0,5 мл полученного разведения инсулина, что составит 2 инсулиновых единицы.

3. Через 30, 45, 60 мин после введения инсулина из ушной вены кролика брать каждый раз по 0,1 мл крови для определения уровня сахара в крови орто-толуидиновым методом. Глюкоза при нагревании с орто-толуидином в растворе уксусной кислоты дает зеленое окрашивание, интенсивность которого пропорциональна концентрации глюкозы:

D-глюкоза + о-толуидин  продукт конденсации зеленого цвета.

4. Опытная проба. В центрифужную пробирку наливают 0,9 мл 3 % раствора трихлоруксусной кислоты и вносят в нее 0,1 мл крови. Центрифугируют в течение 10 мин при 3000 об/мин. Надосадочную жидкость (центрифугат) сливают в чистую пробирку. Далее 0,5 мл центрифугата вносят в пробирку, добавляют 2 мл орто-толуидинового реактива, закрывают стеклянной пробкой и помещают в кипящую водяную баню на 8 мин, развивается зеленое окрашивание. Охлаждают под струей холодной воды. Колориметрируют на фотоэлектроколориметре (оранжевый или красный светофильтр) в кювете 5 мм против воды.

5. Стандартна проба. Стандартную пробу готовят как опытную, но вместо крови вносят 0,1 мл стандартного раствора глюкозы (5,6 ммоль/л), перемешивают, отмеривают 0,5 мл этого раствора в новую пробирку, добавляют 2 мл орто-толуидинового реактива, кипятят на водяной бане, охлаждают, а затем колориметрируют.

6. Расчет.

Концентрация сахара = С_ст*(Е_оп/Е_ст) [ммоль/л],

где С_ст – концентрация глюкозы в ммоль/л в стандартном растворе 5,6 ммоль/л;

Е_оп – экстинция опытной пробы;

Е_ст – экстинция стандартного раствора.

Литература:

1. Биологическая химия: Руководство к лабораторным занятиям/ Сост. Комов В.П., Шведова В.Н., Кириллова Н.В., Спасенкова О.М., Фирсова В.И., Троицкая Л.А. – СПб.: СПХФА. – 1998.

2. Биотехнология в 8-ми томах/ Под ред. Егорова Н.С., Самуилова В.Д. – М.: Высш.шк. – 1988.

3. Биотехнология: получение лекарственных средств и перспективы развития/ А.И. Тенцова, Л.М. Брагинцева, Т.К. Устынюк// Фармация: научно-практический журнал. – М.: Медицина. – 1988.

4. Биотехнология: принципы и применения/ Под ред. Хиггинса И., Беста Д., Джонса Дж. – М.: Мир. – 1988.

5. Биотехнология: состояние и перспективы развития: Материалы 1-ого Международного конгресса (Москва, 14 – 18 окт. 2002 г.). – М.: ЗАО «ПИК Максима», РХТУ им. Д.И. Менделеева. – 2002. – 544 с.

6. Елинов Н.П. Основы биотехнологии. СПб.: ИФ Наук. – 1995.

7. Лекционный материал по биотехнологии.

8. Основы биотехнологии: Методические рекомендации к занятиям/ Сост. С.В. Гурина, Т.С. Потехина. – СПб.: СПХФИ. – 1997. – 44 с.

9. Петров В.А., Г.А. Заболотная ИНДУКТОРЫ ИНТЕРФЕРОНОВ В ЛЕЧЕНИИ И ПРОФИЛАКТИКЕ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ. – Волгоград: ВМА. – 2001.

10. Сассон А. Биотехнология: свершения и надежды/ Пер. с англ. Мехедова С.Л., Миркина С.М. – М.: Мир. – 1987.

11. Сельскохозяйственная биотехнология: Учеб./ Под ред. В.С. Шевелухи. – М.: Высш. шк. – 1988. – 416 с.

12. Словарь по биотехнологии/ Симонян А.В., Покровская Ю.С. – Волгоград. – 2002.

13. Чуешов В.И. Промышленная технология лекарств: Учебник в 2-х т./ Под ред. Чуешова В.И. – Харьков: МТК - Книга; Издательства НФАУ. – 2002. – 716 с.

Темы рефератов.

1. Биотехнологическое производство рекомбинантного инсулина.

2. Создание рекомбинантных белков «второго поколения» на примере инсулина.

3. Биотехнологическое производство интерферона.

4. Проблемы стандартизации препаратов интерферона.

5. Особенности микробиологического производства интерлейкинов.

6. Перспективы биотехнологического производства интерлейкинов с применением методов генетической инженерии.

7. Микробиологический синтез гормона роста человека.

8. Проблемы конструирования продуцентов гормона роста человека методами генной инженерии.

9. Промышленное биотехнологическое производство пептидных факторов роста