45. Вывод и анализ уравнения Михаэлиса-Ментен для односубстратной ферментативной реакции.

В 1913 году Михаэлис и Ментен опубликовали свою теорию общего механизма ферментативных реакций. Их уравнение стало фундаментальным принципом всех кинетических исследований ферментов вот уже почти целый век.

Уравнение Михаэлиса-Ментен.

Михаэлис и Ментен предположили, что механизм ферментативных реакций описывается моделью:

(2.1) в которой скорость реакции определяется распадом фермент-субстратного комплекса

v₀ = k₂(ES) (2.2)

Модель предполагает, что равновесие между свободными ферментом, субстратом и фермент-субстратным комплексом устанавливается быстро по сравнению со скоростью реакции (быстро устанавливающееся равновесие, k₂<< k₁, k_-1). В этом случае вторая стадия реакции практически не влияет на первую, и для выражения концентрации фермента можно воспользоваться константой диссоциации. Ks=(E)*(S)/(ES) ОТСЮДА (E)= Ks*(ES) /(S) (2.3)

Общая концентрация фермента в реакционной смеси выражается уравнением материального баланса

[ E ] ₀=[ E ] + [ ES ] =[ ES ] (K_S/[ S ] + 1)(2.4)

Тогда концентрация фермент-субстратного комплекса равна:

[ ES ] =[ E ] _0*[ S ] / K_S +[ S ] (2.5)

Это уравнение соответствует изотерме адсорбции Ленгмюра, показывая, что фермент действует как гетерогенный катализатор. Реакция достигает максимальной скорости, когда весь фермент находится в комплексе с субстратом

V_max= k₂[ ES ] _max= k₂[ E ] ₀(2.6)

Это условие выполняется, если реакция протекает при избыточной концентрации субстрата: [ S ] ₀>> [ E ] ₀. Из уравнений (2.2), (2.5) и (2.6) получим:

(2.7)

Это и есть классическое уравнение Михаэлиса-Ментен, которым и сегодня пользуются для описания кинетики ферментативных процессов.

Ограничения кинетики Михаэлиса-Ментен

Михаэлис и Ментен вывели уравнение с учетом двух предположений (быстро устанавливающееся равновесие и избыток субстрата). Позднее было показано, что уравнение справедливо, то есть хорошо описывает реакцию, при выполнении всех следующих условий.

7 Основных постулатов для выполнения уравнения Михаэлиса-Ментен.

• В ходе реакции образуется кинетически устойчивый фермент-субстратный комплекс.

• Определяемая с помощью уравнения константа Кs является константой диссоциации фермент-субстратного комплекса: это справедливо, только если k₂<< k₁, k_-1.

• Концентрация субстрата не меняется в ходе реакции, то есть [ S ] = [ S ] ₀.

• Продукт реакции быстро отщепляется от фермента, то есть реакция двухстадийная.

• Вторая стадия реакции необратима. Так как это практически не выполнимо, мы принимаем во внимание только начальные скорости.

• C каждым активным центром фермента связывается только одна молекула субстрата.

• Для всех реагирующих веществ вместо активностей можно использовать их концентрации

При формулировке кинетического выражения для скорости ферментативной реакции Михаэлис и Ментен сделали три допущения: 1) Стационарное состояние реакции в момент равновесия, когда скорости образования и расходования ES равны; 2) Весь фермент в условиях насыщающих концентраций субстрата превращается в энзимсубстратный комплекс ES; 3) Если весь фермент в виде ES, то скорость реакции максимальна и Vmax=k₂[ES]. Образование ES: [ES]=k₁[S][E] (I) Расходование ES: [ES]=k_-1[ES]+k₂[ES] (II) Приравнивая выражения (I) и (II) и сокращая обе части на k₁ получаем: [S][E] = [ES](k_-1 + k₂)/k₁ = [ES]Km, где Km = (k_-1 + k₂)/k₁ Выразим равновесную концентрацию [E] через начальную [Eo]: [E] = [Eo] - [ES] [S]([Eo]-[ES])= [ES]Km, переносим [S] в правую часть выражения и делим обе части на [ES]: [Eo]/[ES]=Km/[S]+1= (Km+[S])/[S] (III) Поскольку трудно (если не невозможно) измерить [ES], произведем замену с учетом того, что в насыщающих концентрациях [S] весь [Eo] перейдет в [ES] и максимальная скорость при этом будет равна Vmax=k₂[ES]=k₂[Eo]. В это же время скорость реакции равна V=k₂[ES]. Через отношение этих скоростей выразим [Eo]/[ES]: V/Vmax= [ES]/[Eo] В уравнении (III) произведем замену отношения [Eo]/[ES] на Vmax/V и получаем: V = Vmax[S]/(Km+[S]) Это и есть уравнение Михаэлиса-Ментен.