Лактозный оперон e.Coli

Оперон, обеспечивающий у E.coliспособность к сбраживанию молочного сахара – лактозы, состоит из промотора, оператора и трех структурных генов. Ген lac Z кодирует фермент- генгалактозидазу, катализирующую гидролиз лактозы до глюкозы и галактозы; ген lac Y-галактозидпермеазу, обеспечивающую транспорт различных сахаров, включая лактозу, мелибиозу и рафинозу, в клетку; ген lac А –тиогалактозидтрансацетилазу, роль которой обычно в утилизации лактозы не ясна. Все три белка обычно присутствуют в клеткахЕ.coliв следовых количествах. Однако при выращивании бактерий на среде, в которой единственным источником углерода и энергии служит лактоза, количество указанных ферментов увеличивается в 1000 раз.

Ген–регулятор лактозного (lac) оперона, обозначаемый lac 1, кодирует белок–репрессор. В активной форме это тетрамер, образованный четырьмя копиями продукта гена lac 1 – полипептидами, состоящими из 360 аминокислот. Клетки с мутациями в гене lac 1 конститутивны по синтезу ферментов, кодируемых генами lac Z, Y и A.

Конститутивный синтез продуктов этих генов возможен не только в случае lac 1 _-мутаций в гене репрессоре, но и в случае мутаций в операторе, обозначаемых О. Такие мутации всегда цис–доминантны, поскольку, в отличие от гена–репрессора, оператор может влиять на возможность транскрипции структурных генов только тогда, когда он находится непосредственно рядом с промотором. Если в клетке находится индуктор, он конкурирует с оператором за молекулы репрессора, причем репрессор в первую очередь связывается с индуктором.

В качестве индукторов могут служить различные соединения. Лактоза представляет собой индуктор и одновременно субстрат. В нормальных клетках даже в отсутствие индуктора остаточная активность пермеазы и –галактозидазы обеспечивают возможность проникновения в клетку минимального количества лактозы, которая в результате реакции, катализируемой–галактозидазой, переходит в аллолактозу. Последняя связывается с репрессором, обусловливая его отсоединение от оператора, что, в свою очередь, открывает путь РНК–полимеразе для связывания с промотором и транскрипции генов lac Z, Y и A. К соединениям, являющимся только индукторами, но не субстратами, относятся изопропил–D–тиогалактопиранозид (ИПТГ) и тиометил––D–галактопиранозид (ТМГ), часто используемые для исследования регуляции lac–оперона.

Мутации в промоторе в отличие от мутаций в гене–репрессоре и в операторе не влияют на индуцируемость оперона, однако они регулируют уровень его экспрессии, изменяя эффективность присоединения РНК–полимеразы, и тем самым частоту инициации транскрипции lac–оперона.

Наряду с негативной системой регуляции, lac–оперон контролируется и с помощью позитивно действующих элементов. Их обнаружение связано с исследованием феномена Ж. Моно диаусией, суть которого состоит в том, что утилизация лактозы начнется лишь после того, как будет использована вся имеющаяся в среде глюкоза. Этот феномен, как установили Б. Магазаник с соавторами, - одно из проявленийкатаболитной репрессии или глюкозного эффекта, известного еще с 40-х годов и выражающегося в неспособностиE.coli, катаболизировать различные углеводы (лактозу, арабинозу, галактозу и др.) в присутствии глюкозы, как более эффективного источника энергии.

Расшифровать механизм глюкозного эффекта сумели Р. Перлман и А. Пастан, обнаружившие, что транскрипция lac–оперона контролируется двумя элементами: небольшой молекулой–эффектором, циклическим аденозинмонофосфатом (цАМФ) и белком–активатором САР (от первых букв англ. Catabolite fctivator protein– белок-активатор катаболизма), называемым также белком–рецептором цАМФ. У эукариот цАМФ является медиатором действия гормонов. Оказалось, что добавление цАМФ к растущим в среде с глюкозой клеткам E .coliхотя и замедляет скорость их роста, но снимает катаболическую репрессию, обусловливая тем самым возможность экспрессии лактозного оперона в условиях одновременного присутствия в среде лактозы и глюкозы. Позднее была показана обратная зависимость между содержанием в клетке цАМФ и глюкозы: глюкоза подавляет активность фермента, синтезирующего цАМФ из АТФ. Этот фермент, названныйаденилатциклазой, кодируется геномсуа.

В структуре промотора lac–оперона выявлено два сайта связывания. Один из них взаимодействует с РНК – полимеразой, другой – с комплексом САР–цАМФ. Присоединение комплекса САР–цАМФ к своему сайту на промоторе – условие индукции оперона. Следовательно, этот комплекс позитивно контролирует транскрипцию lac–оперона. Белок САР состоит из двух идентичных субъединиц с общей Моколо 45000, кодируемых геном САР, илиCRP. Мутации в генесарнарушают участок связывания белка с цАМФ, либо расширяют спектр кофакторов, объединение с которыми обеспечивает индукцию ферментов lac–оперона. У некоторых мутантов в генесартаким кофактором наряду с цАМФ может служить и цГМФ.

В норме, то есть в присутствии глюкозы и в отсутствии цАМФ, белок САР не может объединяться с промотором lac–оперона. В свою очередь, РНК–полимераза не способна эффективно связываться с этим промотором, если к нему не присоединен комплекс САР–цАМФ. Некоторые мутации в промоторе обусловливают независимость экспрессии lac – оперона от глюкозного эффекта, снижая сродство промотора к комплексу САР–цАМФ.

Таким образом, транскрипция lac–оперона на самом деле находится под двойным – негативным и позитивным– контролем. Комплекс САР–цАМФ позволяет РНК–полимеразе присоединиться к матричной ДНК до начала транскрипции. Репрессор – продукт гена lac 1–препятствует инициации синтеза иРНК.

В настоящее время расшифрована полная нуклеотидная последовательность регуляторной области lac–оперона, включающая промотор и оператор. Более того, ДЖ. Шапиро и ДЖ. Беквит с соавторами (1969) сумели выделить чистую ДНК этого оперона, включающую фрагмент гена lac1, полностью промоторную и операторную последовательности, ген lac Z , а также фрагмент гена lac Y. Выяснение структурной организации оператора lac–оперона показало, что существенную роль во взаимодействиях мультимерных белков типа lac–репрессора или РНК–полимеразы с ДНК играют симметричные структуры – палиндромы. Оператор lac–оперона состоит из 26 п.н., из которых 14 представляют собой палиндром: в различных цепях они читаются одинаково, но в противоположных направлениях. Палиндром обнаружен и в участке промотора, связывающемся с комплексом САР–цАМФ.