Методические указания к практической работе

Продолжительность занятия: 3 академических часа (135 минут)

Место проведения занятия: учебная аудитория

Материально-техническое оснащение – таблицы, стенды, микроскопы, микропрепараты, вакцины

Хронометраж практического занятия:

1. Вводное слово преподавателя – 5 мин

2. Проверка исходного уровня знаний (тест-контроль) – 15 мин

3. Разбор теоретических вопросов по теме – 80 мин

1. Виды сальмонелл, вызывающие пищевые токсикоинфекции

2. Классификация сальмонелл по антигенной структуре

3. Эпидемиология пищевых сальмонеллезов

4. Виды сальмонелл, вызывающих внутрибольничные сальмонеллезы

5. Биологические особенности сальмонелл, вызывающих внутрибольничные инфекции

6. Особенности эпидемиологии внутрибольничных сальмонеллезов

7. Лабораторный диагноз сальмонеллезов

8. Специфическая профилактика сальмонеллезов

4. Выполнение практической работы – 35 мин

Практическая работа

1. Изучение колоний сальмонелл и других коли-формных бактерий на хромогенном Рамбах-агаре (зарисовать)

Принцип селективного определения заключается в ферментации сальмонеллами пропиленгликоля до кислоты. Под действием кислоты смесь рН-индикаторов среды окрашивает колонии сальмонелл в красный цвет. На Рамбах-агаре легко отличить Н₂S-продуцирующие штаммы Citrobacter от сальмонелл: первые – синего, вторые – красного цвета. Посев инкубируется в аэробных условиях при 37±1 °С в течение 24±3 ч. Колонии сопутствующих колиформных бактерий (Е. соli, Klebsiella pneumoniae) сине-зеленой окраски, колонии Shigella и Proteus – бесцветные либо слегка желтоватые. Таким образом, выросшие на Рамбах-агаре колонии сальмонелл легко отличить от всех других представителей семейства энтеробактерий.

2. Изучение колоний сальмонелл на высокоселективном XLT4-агаре (зарисовать)

Принцип определения сальмонелл основан на продуцировании бактериями сероводорода при их выращивании на высокоселективном XLT4-агаре. При этом колонии сальмонелл черной или красно-фиолетовой (с черным центром) окраски. Оптимальному росту сальмонелл способствуют пептон, дрожжевой экстракт и лизин; тергитол-4 эффективно подавляет рост протея (в отличие от дезоксихолата в XLD-агаре). Это практически полностью исключает возможность ложноположительных результатов при содержании в пробе Н₂S-продуцирующих штаммов протея. Посев инкубируется в аэробных условиях при 35–37 °С в течение 18–24 ч. Выявление бактерий на XLT4-агаре хорошо дополняет исследования, выполненные на Рамбах-агаре. Селективное выявление сальмонелл – важное преимущество XLT4-агара при исследовании таких продуктов, как мясной фарш, содержащий большое количество сопутствующей микрофлоры.

2. Изучение схемы патогенеза сальмонеллеза (установить связи в схеме 2, оформить протокол)

Схема 2

Схема патогенеза сальмонеллеза

Возбудитель	Входные ворота
Гастроинтестинальная форма заболевания	Внедрение в энтероцит
	Колонизация
Бактериемия	Незавершенный фагоцитоз
Мезентеральные лимфоузлы	Размножение и разрушение сальмонелл
Размножение и разрушение сальмонелл	Выделение эндотоксина
	Эндотоксинемия
Выделение эндотоксина
Диссеминация в органы
	Генерализованная форма

4. Изучение бактериологической диагностики сальмонеллеза по схеме (записать в тетрадь)

Основным методом лабораторного исследования является бактериологический метод, основанный на выделении возбудителя. Кроме не­го используется серологический метод, с помощью которого определяют антитела в сыворотке больных людей.

При постановке бактериологического диагноза материалом для исследования служат промывные воды желудка, рвотные массы, кровь, моча, испражнения и материал, полученный на вскрытии. Пробы отбирают в стерильных условиях в стерильные банки с притертой пробкой, обертывают их плотной бумагой, обвязывают шпагатом и пломбируют. Собранный материал поставляют в лабора­торию, как можно быстрее, с сопроводительным документом и изучают его, независимо от количества и состояния.

Кровь исследуют с пер­вого дня болезни, её берут асептично из локтевой вены в объеме 10–20 мл и тут же у постели больного засевают во флаконы с элективной средой (среда Рапопорт или 20% желчный бульон) в объеме 100–200 мл. Так как при токсикоинфекциях период бактериемии ко­роткий, то этот материал исследуют в первые дни болезни.

Испражнения исследуют с первых дней болезни, для этого берут 3–5 г испражнений, помещают в пробирку с 30% глицериновой смесью и доставляют в лабораторию. Собранный материал встряхивают, эмульгируя его в консерванте, затем одну каплю эмульсии наносят на поверхность питательной среды и досуха втирают стеклянным шпателем на месте посева, а затем по всей поверхности.

Моча исследуется с первых дней заболевания. Мочу забирают стерильным катетером в стерильную посуду, сливают первую порцию, из оставшейся 20–30 мл наливают в центрифужные пробирки, центри­фугируют или отстаивают, осадок высевают на дифференциально-диагностичские среды и одну из сред обогащения.

Рвотные массы и промывные воды желудка забирают в стериль­ную посуду. Они, как правило, имеют кислую реакцию, поэтому пе­ред посевом их нейтрализуют 5–10% раствором бикарбоната натрия, 2–3 капли из верхнего слоя засевают на дифференциально-диагностические среды и среды обогащения.

Материал вскрытия: кусочки печени, селезенки, почек, кост­ного мозга, тонкого кишечника, а также кровь и желчь набирают стерильной пастеровской пипеткой, место введения пипетки предва­рительно прожигают раскаленным скальпелем. Кусочки органов берут стерильными ножницами и пинцетами, затем их растирают в стериль­ной ступке и высевают на дифференциально-диагностические среду и среду обогащения.

Каждый случай пищевой токсикоинфекции или внутрибольничного сальмонеллеза требует обязательного расследования, поэтому кроме бактериологического обследования больного, исследуют остатки пищи, полуфабрикаты и сырые продукты на обсемененность сальмонеллами. Пробы отбирают в стерильную посуду. Жидкие и полужидкие продукты тщательно размешивают, засевают по 2–3 капли на дифференциально-диагностические среды и среды обогащения. При исследовании твердых продуктов пробу берут из глубины в количестве 5–10 мл стерильным скальпелем или ножом, эмульгируют в изотоническом растворе хлорида натрия в соотношении 1:5 и засевают на дифференциально-диагностические среды и среды обогащения.

Дальнейшее исследование ведут в общей схеме исследования на сальмонеллез.

На второй день изучают колонии, выросшие на дифференциально-диагностических средах. На среде Эндо, Плоскирева сальмонеллы образуют бесцветные, блестящие, прозрачные колонии; на среде Вильсон-Блера блестящие, черные колонии, на месте снятых колоний остается черный след. Несколько подозрительных колоний выделяют на среде Олькеницкого, производя посев на скошенную поверхность и в глубину столбика.

Из селективных сред делают посев на чашки с дифференциально-диагностическими средами.

На третий день вынимают пробирки с посевами и изучают характер их роста. В состав среды Олькеницкого входят лактоза, глюкоза, сахароза, мочевина и индикатор. Глюкозы содержится в 10 раз меньше, чем других веществ, поэтому расщепление ее идет в анаэробных условиях, среда изменит цвет в столбике. Если выделенные культуры ферментируют лактозу и мочевину (среда изменяет цвет в столбике и скошенной поверхности), то это не сальмонеллы, выдается отрицательный ответ.

Для дальнейшего изучения отбирают культуры, ферментирующие только глюкозу. У выделенных культур изучают подвижность в висячей капле или в раздавленной капле, выявляют ферментативную активность на средах Гисса, пептонной воде, изучают морфологию в мазках, окрашенных по Граму и проводят анализ антигенной структуры в реакции агглютинации на стекле с поливалентной О- и монорецепторными сальмонеллезными О- и Н- сыворотками. Начинают идентификацию с реакции агглютинации на стекле с поливалентной О-сывороткой основных серологических групп В,С, Д, Е. При положительном результате культуру изучают с монорецепторными сыворотками, входящими в смесь, с каждой в отдельности, для установления серогруппы. Если результат с поливалентной сывороткой отрицательный, культуру испытывают с сывороткой к редким группам сальмонелл.

После установления серогрупп определяют вид культуры, сначала по Н-антигену первой фазы, а потом второй фазы, ставя реакцию агглютинации с монорецепторными Н-сыворотками.

Для реакций агглютинации используют культуры, выращенные на среде Олькеницкого, при этом для реакции агглютинации с О-сывороткой культуру берут из верхней части скошенного агара, a для агглютинации с Н-сыворотками из самой нижней части (конден­сационной воды)_, где возбудители наиболее подвижны. Установив антигенную структуру, по таблице определяют видвыделенной саль­монеллы. Для уточнения вида выделенных атипичных сальмонелл изу­чают дополнительные дифференциальные признаки – способность к валообразованию и биологическую пробу на белых мышах. Если культура по морфологическим, культуральным и фермен­тативным свойствам, а также антигенной структуре типична, то дают заключение об обнаружении сальмонелл с указанием серологического типа.

4. Знакомство с препаратами для специфической диагностики, профилактики и лечения сальмонеллеза (записать в тетрадь)

Бактериофаг сальмонеллезный групп АВСДЕ жидкий представляет собой фильтрат фаголизата нескольких типов наиболее распространенных сальмонелл. Применяется для лечения и профилактики сальмонеллезов.

ЗАНЯТИЕ 7

Тема. Стафилококки. Staphylococcus. Морфология, биология, культуральные свойства. Современная классификация. Лабораторный диагноз стафилококковых инфекций. Специфическая профилактика и терапия стафилококковых инфекций

Цель занятия. Рассмотреть основные свойства стафилококков, изучить их роль в патологии человека, ознакомиться со схемой бактериологического диагноза, изучить препараты для специфической профилактики и терапии