6. Перечень практических умений по изучаемой теме

1. Умение пользоваться учебной научной, научно-популярной литературой, сетью Интернет для профессиональной деятельности

2. Умение работать с кариотипами и их раскладкой в соответствии с Денверской и Парижской классификациями.

3. Умение грамотно и информативно записывать наследственные патологии хромосомных и геномных мутаций.

7. Примерная тематика нирс по теме.

1. Современные методы определения полового хроматина у обратившихся в медико-генетическую консультацию.

- информационный поиск по данной теме

- обработка информации (плюсы и минусы)

- выводы и рекомендации по современным методам.

2. Изучение частоты встречаемости больных фенилкетонурией среди дошкольников городской зоны.

- информационный поиск по данной теме

- изучение медицинской документации по данной теме

- статистическая обработка полученного материала

- выводы и рекомендации по результатам исследования

Дополнительная информация по теме

Цитогенетический метод (Кариотипирование)

Цитогенетический метод используют для изучения нормального кариотипа человека, а также при диагностике наследственных заболеваний, связанных с геномными и хромосомными мутациями.

Кроме того, этот метод применяют при исследовании мутагенного действия различных химических веществ, пестицидов, инсектицидов, лекарственных препаратов и др.

В период деления клеток на стадии метафазы хромосомы имеют более четкую структуру и доступны для изучения. Диплоидный набор человека состоит из 46 хромосом:

22 пар аутосом и одной пары половых хромосом. У женщины это две X хромосомы (кариотип: 46, ХХ), а у мужчин одна Х хромосома, а другая – Y (кариотип: 46, ХY).

Обычно исследуют лейкоциты периферической крови человека, которые помещают в специальную питательную среду, где они делятся. Затем готовят препараты и анализируют число и строение хромосом. Разработка специальных методов окраски значительно упростила распознавание всех хромосом человека, а в совокупности с генеалогическим методом и методами клеточной и генной инженерии дала возможность соотносить гены с конкретными участками хромосом. Комплексное применение этих методов лежит в основе составления карт хромосом человека.

Цитологический контроль необходим для диагностики хромосомных болезней, связанных с анеуплоидией и хромосомными мутациями. Наиболее часто встречаются болезнь Дауна(трисомия по 21-й хромосоме), синдром Клайнфелтера (47 XXY), синдром Шершевского — Тернера (45 ХО) и др. Потеря участка одной из гомологичных хромосом 21-й пары приводит к заболеванию крови — хроническому миелолейкозу.

При цитологических исследованиях интерфазных ядер соматических клеток можно обнаружить так называемое тельце Барри, или половой хроматин. Оказалось, что половой хроматин в норме есть у женщин и отсутствует у мужчин. Он представляет собой результат гетерохроматизации одной из двух Х-хромосом у женщин. Зная эту особенность, можно идентифицировать половую принадлежность и выявлять аномальное количество Х-хромосом.

Существует два основных типа исследования данным методом:   • изучение хромосом клеток крови пациентов и  • пренатальное кариотипирование, то есть исследование хромосом плода.

Известно много заболеваний, причина которых - нарушение количества и/или строения хромосом, например, нарушения менструального цикла, выкидыши, бесплодие, уродства, умственная отсталость, нарушения иммунитета и сердечной деятельности.

Существуют международные стандарты, рекомендующие исследование хромосом в следующих случаях:   1. наличие хромосомной патологии в семье или у родственников,  2.  привычное невынашивание беременности,  3.  возраст беременной женщины более 35 лет (1 случай из 30 родов - с генетической патологией)  4.  оценка мутагенных воздействий (радиационных, химических и др.).

Пренатальная генетическая диагностика позволяет уверенно определять хромосомную патологию плода уже на ранних сроках беременности, а также определить пол будущего ребенка уже на самых ранних сроках беременности (до 12 недель), тогда как стандартное УЗИ такой точности не гарантирует и на поздних сроках.

Проведение кариотипирования, как правило, назначается врачами-генетиками в двух случаях:

1.      для изучения кариотипа будущих родителей

2.      пренатальное кариотипирование для исследования хромосом плода - один из видов пренатальной (дородовой) диагностики.

Показания для проведения цитогенетических исследований

Показания для цитогенетического исследования достаточно широкие, особенно при акушерско-гинекологической и детской патологии. Ниже приводится перечень (возможно, неполный) состояний, при которых для диагностики надо иметь результаты цитогенетического исследования у пациента (пробанда) и в случае необходимости у его родственников:

- Подозрение на хромосомную болезнь по клинической симптоматике (для подтверждения диагноза).

- Наличие у ребенка множественных врожденных пороков развития, не относящихся к генному синдрому.

- Многократные (более двух) спонтанные аборты, мертворождения или рождения детей с врожденными пороками развития.

- Нарушение репродуктивной функции неясного генеза у женщин и мужчин (первичная аменорея, бесплодный брак и др.).

- Существенная задержка умственного и физического развития у ребенка.

- Пренатальная диагностика (по возрасту, в связи с наличием транслокации у родителей, при рождении предыдущего ребенка с хромосомной болезнью).

- Подозрение на синдромы с хромосомной нестабильностью (учет хромосомных аберраций и сестринских хроматид).

- Лейкозы (для дифференциальной диагностики, оценки эффективности лечения и прогноза).

- Оценка мутагенных воздействий (радиационных, химических).

Медицинских ограничений для применения цитогенетических методов нет. Однако необходимо помнить, что эти методы трудоемкие, дорогие, их назначение наугад не оправдано (по принципу «если неясно, то давайте назначим»). Правильнее назначать цитогенетическое исследование по рекомендации врача-генетика после проведения медико-генетического консультирования.

Для исследования кариотипа человека достаточно получить образец периферической крови в количестве 1-2 мл. Цитогенетический анализ включает три основных этапа: 1) культивирование клеток; 2) окраску препарата; 3) микроскопический анализ препарата. Культивирование клеток проводится следующим образом. После забора образец крови помещают в питательную солевую среду с добавлением цельной сыворотки крупного рогатого скота и белка бобовых растений — фитогемагглютинина, стимулирующего процесс деления клеток.

Анализ на кариотипирование. Кариотипирование лимфоцитов

Для исследования кариотипа, достаточно сдать кровь на анализ. Врачи берут венозную кровь и выделяют из нее лимфоциты. В течение трех дней генетики наблюдают за их ростом и делением, в процессе которого анализируют состав и строение хромосом. Чаще всего исследуется не вся цепочка, а только половые хромосомы и еще три пары (21, 18 и 13-я по счету). Как правило, анализ готов в течение недели, а его результаты интерпретирует врач. Наиболее распространенными отклонениями, которые могут повлиять на репродуктивную функцию организма, являются:

1. Наличие лишней хромосомы;

2. Отсутствие хромосомы в цепочке;

3. Неправильная структура одной хромосомы;

4. Дубляж одного или нескольких фрагментов хромосомы.

Если будущие родители имеют нарушения в структуре ДНК, но беременность уже наступила, врач может назначить кариотипирование плода. Этот анализ также рекомендуют делать всем беременным женщинам старше 35 лет. Кариотипирование плода даст возможность узнать, есть ли у будущего ребенка генетические заболевания и пороки развития. Кроме того, анализ даст возможность точно узнать пол ребенка на раннем сроке беременности.

Цитогенетическое исследование. кариотип

К стандартным процедурам цитогенетического анализа крови относится кариотипирование. С его помощью выявляют нарушения в количестве и структуре хромосом. Очень важно отдать предпочтение клинике, с качественным оборудованием и расходными материалами. Для анализа кариотип, забор клеток крови держат в питательной среде на протяжении 3 суток. Затем происходит фиксация полученного материала и изучение под микроскопом. На данных этапах нужно тщательно проследить за качеством специальных окрашивающих препаратов и уровнем подготовки персонала. Существует также цитогенетическое исследование плода, его назначают при различных подозрениях на генетические отклонения или при неправильном раннем внутриматочном развитии. Частные медицинские центры могут обеспечить надлежащий уровень проведения подобных исследований и выявить различные хромосомные патологии, пороки развития, бесплодие или невозможность выносить ребенка на ранних сроках беременности или до нее. Цитогенетическое исследование костного мозга назначают пациентам с различными видами злокачественных заболеваний в органах системы кроветворения. Во время этого анализа оценивается не менее 20 клеток. Нужно учитывать, что забор материала для исследования должен производиться только в специальном медицинском учреждении, имеющем разрешение на проведение подобных опасных вмешательств. На ранних сроках беременности может потребоваться цитогенетическое исследование хориона. Его проводят на 10-14 неделе беременности с целью исключения хромосомных болезней плода, таких как синдром Дауна, болезнь Хантера, b-талассемия и еще около 50 различных отклонений и заболеваний. Обратившись в частный центр, клиент может быть уверен в качестве обслуживания и достоверности полученных на современном оборудовании результатов анализов.

Нормальные кариотипы человка. А —женщины; Б —мужчины. Вверху представлены хромосомные комплексы, внизу — кариограммы

Денверская классификация хромосом позволяет проанализировать общее число хромосом, определить их принадлежность к той или иной группе, а также выявить грубые хромосомные нарушения (поломки, перемещения участков хромосом, нетипичные конфигурации и др.).

В 1960 г. была предложена Денверская классификация хромосом, которая помимо размеров хромосом учитывает их форму, положение центромеры и наличие вторичных перетяжек и спутников. 23 пары хромосом человека разбили на 7 групп от A до G. Важным параметром является центромерный индекс (ЦИ), который отражает отношение (в %) длины короткого плеча к длине всей хромосомы.

Группа А. Хромосомы 1, 2, 3 пары. Это большие, метацентрические и субметацентрические хромосомы. ЦИ – 38 – 49%.

Группа В (4, 5). Большие субметцентрические хромосомы. ЦИ 24 – 30%.

Группа С (6 – 12 пары и Х-половая хромосома). Хромосомы среднего размера, субметцентричесие. ЦИ 27 – 35%.

Группа D (13 – 15 пары). Акроцентрические. ЦИ около 15%.

Группа Е (16 – 18 пары). Относительно короткие, метацентрические или субметацентрические. ЦИ 26 – 40%.

Группа F (19 – 20 пары): две короткие субметацентрические хромосомы. ЦИ 36 – 46%.

Группа G (21 и 22 пары и Y хромосома): маленькие акроцентрические хромосомы. ЦИ 13 – 33%.

 

Для более точного анализа хромосом используются методы дифференциального окрашивания, которые позволяют идентифицировать хромосомы внутри определенной группы. При дифференциальном окрашивании каждая пара хромосом имеет свой строгоспецифический рисунок!, заключающийся в чередовании окрашенных и неокрашенных полос разной толщины. Рисунок дифференциально окрашенных хромосом является специфической характеристикой кариотипа данного вида организмов.

Для точной идентификации дифференциально окрашенных хромосом используется Парижская номенклатура.

С целью получения дифференциальной окраски цитогенетических препаратов применяют специальные красители – флюрохромы в сочетании с основными красителями, использующимися для рутинной окраски.

Существуют следующие методы дифференциального окрашивания хромосом:

 

Самым популярным способом является G-окрашивание–это стандартный метод цитогенетического анализа. Применяется при выявлении небольших аберраций и маркерных хромосом (сегментированных иначе, чем нормальные гомологичные хромосомы).

Q-окрашивание – окрашивание акрихин-ипритом с исследованием под флуоресцентным микроскопом. Чаще всего применяется для исследования Y-хромосом (быстрое определения генетического пола, выявление транслокаций между X- и Y-хромосомами или между Y-хромосомой и аутосомами, скрининг мозаицизма с участием Y-хромосом). При Q–окраске число, величина и расположение сегментов в хромосоме аналогично рисунку при G-окраске.

R-окрашивание – используется акридиновый оранжевый и подобные красители, при этом окрашиваются участки хромосом, нечувствительные к G-окрашиванию. R-сегменты окрашиваются после контролируемой тепловой денатурации. Используется для выявления деталей гомологичных G- или Q-негативных участков сестринских хроматид или гомологичных хромосом.

C-окрашивание - применяется для анализа околоцентромерных районов хромосом, содержащих конститутивный гетерохроматин, а также дистальной части Y-хромосомы.

Кариотипирование – цитогенетический метод - позволяющий выявить отклонения в структуре и числе хромосом, которые могут стать причиной бесплодия, другой наследственной болезни и рождения больного ребенка.

Система записи кариотипов

46, XX — нормальный кариотип (женщина) 46, XY — нормальный кариотип (мужчина) 45, X — синдром Шерешевского-Тернера 47 XXY 1 4g' xxxY I — синдром Клайнфельтера 47, XXX — синдром «трисомии по Х-хромосоме» 47, XYY — синдром Вай-Вай 47, XX, + 21 — синдром Дауна (женщина) 47, XY, + 21 — синдром Дауна (мужчина) 47, XX, + 18 — синдром Эдвардса (женщина) 47, XY, + 18 — синдром Эдвардса (мужчина) 47, XX, + 13 — синдром Патау (женщина) 47, XY, + 13 — синдром Патау (мужчина) 46, XX, t (9/22) — хронический миелолейкоз (женщина) 46, XY, t (9/22) — хронический миелолейкоз (мужчина) 46, XX, t (15/21) — транслокационный Даун (женщина) 46, XY, t (15/21) — транслокационный Даун (мужчина) 46, XX, del (5p-) — синдром кошачьего крика (женщина) 46, XY, del (5р-) — синдром кошачьего крика (мужчина) 46, XX, del (13q-) — синдром Орбели (женщина) 46, XY, del (13q-) — синдром Орбели (мужчина)

Цитогенетический метод изучения генетики человека. Определение Х- и У-хроматина.

Метод используется для диагностики хромосомных заболеваний, связанных с нарушениями числа половых хромосом в кариотипе. Определение Х- и Y-хроматина часто называют методом экспресс-диагностики пола. Исследуют клетки слизистой оболочки ротовой полости, вагинального эпителия или волосяной луковицы. В ядрах клеток женщин в диплоидном наборе присутствуют две хромосомы Х, одна из которых полностью инактивирована (спирализована, плотно упакована) уже на ранних этапах эмбрионального развития и видна в виде глыбки гетерохроматина, прикреплённого к оболочке ядра. Инактивированная хромосома Х называется половым хроматином или тельцем Барра. Для выявления полового Х-хроматина (тельца Барра) в ядрах клеток мазки окрашивают ацетарсеином и препараты просматривают с помощью обычного светового микроскопа. В норме у женщин обнаруживают одну глыбку Х-хроматина, а у мужчин её нет. Для выявления мужского Y-полового хроматина (F-тельце) мазки окрашивают акрихином и просматривают с помощью люминисцентного микроскопа. Y-хроматин выявляют в виде сильно светящейся точки, по величине и интенсивности свечения отличающейся от остальных хромоцентров. Он обнаруживается в ядрах клеток мужского организма.

Отсутствие тельца Барра у женщин свидетельствует о хромосомном заболевании — синдроме Шерешевского-Тернера (кариотип 45, Х0). Присутствие у мужчин тельца Барра свидетельствует о синдроме Кляйнфелтера (кариотип 47, ХХY).Определение Х- и Y-хроматина — скрининговый метод, окончательный диагноз хромосомной болезни ставят только после исследования кариотипа

Приготовление цитогенетических препаратов путем культивирования лимфоцитов периферической крови

Биохимические методы при генетических исследованиях

Биохимические методы в лабораторной диагностике наследственных болезней применяются с начала XX в. Биохимические показатели (первичный белковый продукт гена, накопление патологических метаболитов внутри клетки и во внеклеточных жидкостях) лучше отражают сущность болезни, чем клинические симптомы, не только в диагностическом, но и в генетическом аспекте. Значимость биохимических методов повышалась по мере описания наследственных болезней и совершенствования этих методов (электрофорез, хроматография, спектроскопия и др.). В 80-х годах ХХ в. был выделен целый раздел - наследственные болезни обмена веществ, т.е. заболевания с различными биохимическими нарушениями. Оценка метаболитов в биологических жидкостях - необходимый этап диагностики аминоацидопатий, органических ацидурий, мукополисахаридозов, митохондриальных и пероксисомных болезней, дефектов метаболизма пуринов и пиримидинов и т.д.

Хроматографические методы анализа играют важнейшую роль в диагностике наследственных болезней обмена.

Масс-спектрометрия - аналитический метод, с помощью которого можно получать как качественную (структура), так и количественную (молекулярная масса или концентрация) информацию от анализируемых молекул после их преобразования в ионы. Существенное отличие масс-спектрометрии от других аналитических физикохимических методов состоит в том, что в масс-спектрометре определяются непосредственно масса молекул и их фрагментов.

Нозологические формы наследственных болезней обмена, которые можно диагностировать с использованием тандемной массспектрометрии,

Основная цель первичной диагностики заключается в том, чтобы выявить здоровых людей и отобрать пациентов для последующего уточнения диагноза. В таких программах первичной диагностики в качестве материала используются моча и небольшое количество крови. Программы первичной биохимической диагностики наследственных болезней могут быть массовыми и селективными. Массовые просеивающие программы используются в диагностике фенилкетонурии, врожденного гипотиреоза, адреногенитального синдрома, врожденных аномалий развития нервной трубки и болезни Дауна.

Показаниями для применения биохимических методов диагностики у новорожденных являются судороги, кома, рвота, гипотония, желтуха, специфический запах мочи и пота, ацидоз, нарушенное кислотно-основное равновесие, остановка роста. У детей биохимические методы используют во всех случаях подозрения на наследственные болезни обмена веществ (задержка физического и умственного развития, потеря приобретенных функций, клиническая картина, специфичная для какой-либо наследственной болезни).

Биохимические методы применяют для диагностики наследственных болезней и гетерозиготных состояний у взрослых (гепатолентикулярная дегенерация, недостаточность α₁-антитрипсина, недостаточность Г6ФДГ и т.д.). Для диагностики многих болезней биохимические методы заменяют молекулярно-генетическими в связи с их большей точностью или экономичностью.

Методы подтверждающей диагностики

Кариотипы с нарушением числа аутосом и половых хромосом

Синдром Морриса

Кариотипы с нарушением числа аутосом и половых хромосом

СИНДРОМ ПОЛИСОМИИ ПО У ХРОМОСОМЕ (47,ХХУ)

- Особи мужского пола

- Имеют высокий рост

- Склонны к асоциальному поведению и криминальным поступкам

Трисомия по Х- хромосоме 47,ХХХ

Синдром Эдвардса 47,+18

Синдром Дауна,47 +21

Синдром Патау, 47,+13

ВНИМАНИЕ!!!

Изучить и уметь анализировать кариотипы в норме и

при анеуплоидии аутосом и половых хромосом.

На практических занятиях – отработка

практических навыков по предложенным легендам и работа с

с раскладкой хромосом в соответствии с Денверской классификацией

(ее надо знать!)