Непрямой метод.

ИФА - иммуноферментный анализ.

Существуем много вариантов постановки ИФА, в том числе - твердофазных, на одном из них мы и остановимся.

В микропланшеты вносят по 0,1 мл раствора известного растворимого антигена в дозе 0,05 мкг на мл. Планшеты оставляют на 24 ч при комнатной температуре, трижды отмывают растворителем.

Делают несколько последовательных разведений исследуемой иммунной сыворотки в пробирках в объеме 0,5 мл, начиная с 1:50. Последней пробиркой является контрольная – без сыворотки. Начиная с контроля, вносят в последнюю лунку планшета 0,1 мл (контроль), в предпоследнюю лунку планшета - 0,1 мл разведения из предпоследней пробирки и т.д. Смесь оставляют на 30 мин при 37^о С и затем трижды промывают лунки растворителем. После этого вносят во все лунки видовой конъюгат по 0,1 мл Смесь выдерживают 40 мин при комнатной температуре и трижды промывают растворителем. А затем вносят субстрат и хромоген.

Предварительно делают конъюгат, как описано выше, только в качестве сыворотки берут кроличью антисыворотку к сывороточным белкам человека, которую метят ферментом каталазой (как описано выше). Получаем видовой конъюгат против белков сыворотки людей. Применение такого препарата более выгодно, чем на основе гомологичной иммунной сыворотки к антигену. Такую сыворотку необходимо готовить заново при новом антигене, а видовой конъюгат можно использовать во всех случаях исследования сывороток людей.

Если исследуемая сыворотка содержала антитела, то происходит взаимодействие ее с антигеном и на Fc-фрагмент ее антител прикрепляются антитела из конъюгата (кроличья антисыворотка к белкам сыворотки человека) меченого ферментом. Он разлагает внесенный в лунки субстрат и хромоген (перманганат калия) не изменит своего красного цвета. Если антител в сыворотке исследуемой нет, то не будет и фермента и субстрат будет действовать на хромоген, который мгновенно изменит цвет среды на желтый (таблица № 24).

Таблица № 24.

Схема постановки непрямого варианта ИФА

Лунки планшет	Последовательность процесса постановки непрямого варианта ИФА
	антиген	процесс отмывания		антисы- воротка	процесс отмывания	конъю- гат	субстрат	хромоген		резуль- тат ИФА
	Дополнительная характеристика вносимых агентов, в мг или мл
	в рабо-чей дозе	фосфатн. буфер + твин-20	- 1:100 или раствори-тель		то же	на 30 мин	перекись водорода на 15 мин		перманга-нат калия		окраска, момен- тально
1-я. Опыт	0,05 мл	3 раза	0,025 мл		3 раза	0,05 мл	0,05 мл		0,05 мл		красная
2-я. Контроль	0,05 мл	3 раза	растворитель по 0,025 мл		3 раза	0,05 мл	0,05 мл		0,05 мл		желтая