Репликация ДНК — это процесс синтеза дочерней молекулы ДНК на матрице родительской молекулы ДНК. Репликация происходит полуконсервативно при помощи ферментов ДНК-полимераз — каждая родительская цепь становится матрицей для синтеза дочерней цепи. Репликация осуществляется почти непрерывно: синтез лидирующей цепи происходит без пауз, а запаздывающая цепь синтезируется в виде фрагментов Оказаки (длиной в 1000 нуклеотидов у прокариот и 100 — у эукариот), которые затем сшиваются ферментами ДНК-лигазами (см. Рис. 49).
Рис. 49. Общая схема репликации ДНК: слева — у прокариот (на примере E. coli), справа — у эукариот
Рис. 50. Репликативная вилка: упрощенная схема
71
Хромосома кишечной палочки E. coli представляет собой суперспирализованную кольцевую ДНК длиной 4,6×106 пар нуклеотидов (4600 килобаз). Этапы инициации:
1.Репликация у E. coli начинается в особом участке — точке ori (oriC). Она включает:
—5 консенсусных последовательностей TT(A/T)T…CACC (R-
сайты);
—область, богатую A·T парами (ДНК-разматывающий уча-
сток);
—3 дополнительных I-сайта.
Восемь молекул белка DnaA (хеликаза) связываются с точкой oriC и разматывают двойную спираль на участке длиной ~45 пар нуклеотидов. Этому способствует большое коли-
чество A·T пар в точке инициации и отрицательные супервитки, образуемые ДНКтопоизомера-
зой II. DnaA ис-
пользует АТФ в качестве источника энергии.
2. C белком DnaA
связываются белки DnaB (тоже хелика-
зы) и тоже разматывают двойную спираль ДНК. Эти белки играют ключевую роль в образовании репликативных вилок, поскольку именно они будут двигаться в разных направлениях и разматывать двойную спираль ДНК в элонгации.
3.Все остальные белки, участвующие в репликации связываются с
DnaB.
4.Хеликазы DnaB движутся по цепи ДНК в направлении 5’→3’, оставляя позади одиночные несвязанные между собой цепи ДНК. Образуется репликативная вилка. Повторному сворачиванию цепей ДНК в двойную спираль препятствуют SSB-белки
72
(single-strand binding, связывающиеся с одной цепью ДНК). ДНКгиразы снимают торсионное напряжение на цепях ДНК.
ДНК-полимераза III у кишечной палочки E. coli синтезирует обе цепи: лидирующую и отстающую. Это происходит внутри крупного белкового комплекса, включающего две ДНК-полимеразы III — реплисомы. Чтобы реплисома могла двигаться в направлении 5’→3’, запаздывающая цепь должна образовать петлю определённым образом (см. Рис. 52 и Приложение 4).
Образование дочерней ДНК, как лидирующей, так и отстающей, требуют синтеза РНК-праймера, фрагмента, к которому полимераза будет присоединять следующие нуклеотиды по принципу комплементарности. Праймер синтезируется праймосомой, состоящей из DnaB и DnaG (праймаза). Длина праймера — 9–11 нуклеотидов. Затем эти праймеры вырезаются и застраиваются ДНК-полимеразой I. Сами фрагменты сшиваются между собой ДНК-лигазами.
Для элонгации очень важно присутствие β-субъединицы ДНКполимеразы III, которую ещё называют «β-хомутом», поскольку она удерживает полимеразу yа цепи ДНК и не даёт ей диссоциировать (отсюда и название — «хомут»). Скорость репликации у E. coli составляет ~1 000 нуклеотидов в секунду.
Рис. 52. Репликативная вилка: схема с учетом современных представлений
В ходе репликации возникают положительные супервитки и торсионное напряжение на цепях ДНК, которые снимаются ферментами ДНКгиразами (ДНК-топоизомеразами II).
Высокая точность репликации ДНК достигается с помощью регуляции концентрации дезоксирибонуклеотидов, низкой частоты ошибок полимеразной реакции, вовлечения в процесс РНК-праймеров, 3’→5’ активности полимеразы (исправление ошибок) и репарации ДНК. Современное представление о процессе репликации приводится в Приложении 4.
73
Участок ДНК у E. coli, на котором происходит терминация, имеет длину 350 тысяч пар нуклеотидов (350 килобаз). Эта область ограничена с двух сторон 10 идентичными непалиндромными сайтами терминации длиной ~23 нуклеотида (см. Рис. 53):
TerH, TerI, TerE, TerD, TerA (с одной стороны) и TerJ, TerG, TerF, TerB,
TerC (с другой). Как правило, репликативная вилка останавливается на одном из этих сайтов. В самом процессе терминации участвует Tus-белок, который связывается с одним из Terсайтов.
Рис. 53. Карта хромосомы E. coli с позициями Ter-сайтов
Эукариоты содержат более 10 ДНК-полимераз, которые объединяют в 6 семейств: A, B, C, D, X и Y. Сами полимеразы обычно называют греческими буквами. ДНК-полимераза α синтезирует праймеры, высокопроцессивная ДНК-полимераза δ синтезирует запаздывающую цепь, ДНКполимераза ε синтезирует лидирующую цепь и может заменить ДНКполимеразу δ в синтезе запаздывающей цепи. ДНК-полимераза β участвует в репарации ДНК. Эукариотическая ДНК имеет множество точек ori. Хромосомы у эукариот содержат теломерные последовательности на 3’- концах цепей (у людей — нуклеотиды TTAGGG), которые обеспечивают точную репликацию концов цепей ДНК. У эукариот имеются аналоги бактериальных белков, участвующих в репликации:
1.Белковый MCM-комплекс выполняет роль хеликазы — аналогичен DnaA.
2.RPA-белки (replication protein A) связываются с цепями ДНК подобно SSB-белкам у прокариот.
3.Ферменты РНКаза H1 и FEN1 (flap endonuclease-1) действуют как прокариотическая ДНК-полимераза I (т.е. вырезают праймер).
4.Белок PCNA (пролиферирующий клеточный ядерный антиген)
является аналогом «β-хомута» прокариот.
Проблема репликации 5’-конца цепи ДНК. ДНК-полимераза не мо-
жет синтезировать 5’-конец запаздывающей цепи. Однако у эукариот есть теломеры — последовательности нуклеотидных остатков на концах ДНК, состоящие из 1000 или более повторов TTAGGG (у людей). Теломеры син-
74