4. Строение, функции и эволюция пиРнк

Пока молекулярным биологам были известны только два вида малых РНК — киРНК и микроРНК — основное «предназначение» РНК-интерференции казалось совершенно понятным. Действительно: набор гомологичных коротких РНК и белков у разных организмов осуществляет аналогичные действия; по мере усложнения организмов усложняется и функциональность.

Однако в процессе эволюции природа создала ещё одну, эволюционно самую позднюю и узкоспециализированную систему на основе всё того же удачного принципа РНК-интерференции. Речь идет о пиРНК (piRNA, от Piwi-interaction RNA).

Чем сложнее организован геном, тем более развит и приспособлен организм. Однако увеличение сложности генома имеет и оборотную сторону: сложная генетическая система становится нестабильной. Это ведет к необходимости механизмов, отвечающих за поддержание целостности генома — иначе самопроизвольное «перемешивание» ДНК просто выведет её из строя. Мобильные генетические элементы (МГЭ) — один из основных факторов нестабильности генома — представляют собой короткие нестабильные участки, которые могут автономно транскрибироваться и мигрировать по геному. Активация таких мобильных элементов приводит к множественным разрывам ДНК в хромосомах, чреватых летальными последствиями.

Количество МГЭ нелинейно увеличивается с размером генома, и их активность необходимо сдерживать. Для этого животные, уже начиная с кишечнополостных, используют всё тот же феномен РНК-интерференции. Эту функцию также выполняют короткие РНК, однако не те, о которых речь уже шла, а третий их тип — пиРНК.

пиРНК — короткие молекулы длиной в 24–30 нуклеотидов, закодированные в центромерных и теломерных областях хромосомы. Последовательности многих из них комплементарны известным мобильным генетическим элементам, однако есть множество других пиРНК, совпадающих с участками рабочих генов или с фрагментами генома, функции которых неизвестны.

пиРНК (также как и микроРНК) закодированы в обеих цепях геномной ДНК; они весьма разнообразны (до 500 тыс. видов в одном организме). В отличие от киРНК и микроРНК, они образуются одной цепью с характерной особенностью — урацилом (U) на 5’-конце и метилированным 3’-концом. Есть и другие отличия:

1. в отличие от киРНК и микроРНК, они не требуют процессинга Dicer’ом;

2. гены пиРНК активны только в зародышевых клетках (во время эмбриогенеза) и окружающих их эндотелиальных клетках;

3. белковый состав системы пиРНК иной — это эндонуклеазы класса Piwi (Piwi и Aub) и отдельная разновидность Argonaute — Ago3.

Процессинг и активность пиРНК пока достаточно плохо изучены, но уже ясно, что механизм действия совершенно отличается от других коротких РНК — сегодня предложена пинг-понг модель их работы (рис.7).

Главная функция пиРНК — подавление активности МГЭ на уровне транскрипции и трансляции. Считается, что пиРНК активны только во время эмбриогенеза, когда непредсказуемые перетасовки генома особенно опасны и могут привести к гибели зародыша. Это логично — когда иммунная система ещё не заработала, клетки эмбриона нуждаются в какой-нибудь простой, но действенной защите. От внешних патогенов эмбрион надежно защищен плацентой (или оболочкой яйца). Но кроме этого необходима оборона и от эндогенных (внутренних) вирусов, — в первую очередь МГЭ.

Эта роль пиРНК подтверждена опытом — «нокаут» или мутации генов Ago3, Piwi или Aub приводят к серьёзным нарушениям развития (и резкому увеличению числа мутаций в геноме такого организма), а также вызывают бесплодие за счёт нарушения развития половых клеток.

Рисунок 12 А - : Цитоплазматическая часть процессинга пиРНК.Биогенез и активность пиРНК опосредуется семейством эндонуклеаз Piwi (Ago3, Aub, Piwi). Активность пиРНК обеспечивается обеими одноцепочечными молекулами пиРНК — смысловой и анти-смысловой, — каждая из которых ассоциирует со специфической эндонуклеазой Piwi. пиРНК узнает комплементарный участок мРНК транспозона (синяя цепь) и вырезает его. Это не только инактивирует транспозон, но и создает новую пиРНК (связанную с Ago3 с помощью метилирования метилазой Hen1 3’-конца). Такая пиРНК, в свою очередь, узнаёт мРНК с транскриптами кластера предшественников пиРНК (красная цепь) — таким способом цикл замыкается и снова вырабатывается нужная пиРНК [1]

Рисунок 7 Б -пиРНК в ядре. Кроме эндонуклеазы Aub, антисмысловую пиРНК может связывать и эндонуклеаза Piwi. После связывания комплекс мигрирует в ядро, где вызывает деградацию комплементарных транскриптов и перестройку хроматина, вызывающую подавление активности транспозонов[1]

Распространение и эволюция пиРНК. Первые пиРНК обнаруживаются уже у актиний и губок. Растения, видимо, пошли другим путём — белки Piwi у них не обнаружены, а роль «намордника» для транспозонов выполняют эндонуклеаза Ago4 и киРНК.

У высших животных — в том числе и человека — система пиРНК развита очень хорошо, но встретить её можно только в эмбриональных клетках и в околоплодном эндотелии. Почему распространение пиРНК в организме столь ограничено — ещё предстоит узнать. Можно предположить, что, как и любое мощное оружие, пиРНК приносит пользу только в очень специфических условиях (во время развития плода), а во взрослом организме их активность нанесёт больше вреда, чем пользы. Все-таки, число пиРНК на порядок превосходит количество известных белков — и неспецифические эффекты пиРНК в зрелых клетках сложно предсказать.

На рисунке 8 представлена таблица, иллюстрирующая эволюцию белкового аппарата, участвующего в РНК-интерференции. Видно, что у простейших наиболее развита система киРНК (белковые семейства Ago, Dicer), а с усложнением организмов акцент переносится на более специализированные системы — увеличивается число изоформ белков для микроРНК (Drosha, Pasha) и пиРНК (Piwi, Hen1). При этом разнообразие ферментов, опосредующих действие киРНК, уменьшается.

Рисунок 8. Многообразие белков, участвующих в РНК- интерференции (цифры обозначают количество белков каждой группы). Синим цветом подсвечены элементы, характерные для киРНК и микроРНК, а красным — белки, связанные с пиРНК [1]

Явление РНК-интерференции начали использовать уже простейшие организмы. На основе этого механизма природа создала прототип иммунной системы, а по мере усложнения организмов РНК-интерференция становится незаменимым регулятором активности генома. Два разных механизма плюс три вида малых РНК (см. таблицу) — в результате мы видим тысячи тонких регуляторов различных метаболических и генетических путей. Эта поразительная картина иллюстрирует универсальность и эволюционную адаптацию молекулярных биологических систем. Правда, такая фантастическая сложность говорит скорее о том, что эволюция «слепа» и действует без наперёд утверждённого «генерального плана».

5. Перспективы практического использования малых РНК

С открытием РНК-интерференции появились возможности создания лекарственных препаратов нового поколения. Обычно лекарства действуют на уровне конечных стадий биохимического «производства», они выключают (или «ломают») «работающие станки» (биомолекулы) или уничтожают «готовые изделия» (например, ферменты). РНК-интерференция предлагает другую стратегию: не «обезвреживать» нежелательный биохимический продукт (рискуя нарушить заодно и какой-нибудь нормально протекающий процесс), а просто «натравливать» собственный защитный механизм клетки – RISC – на определенную информационную РНК (по аналогии с цехом – «рабочие чертежи»), таким образом предотвращая образование нежелательного продукта. Достаточно сконструировать правильную si-РНК. Это выполнимая задача, поскольку геном человека «прочитан», и для некоторых болезней известны вполне определенные гены, за них ответственные.

Таблица - Сравнительная характеристика малых РНК

Характеристика	киРНК	микроРНК	пиРНК
Распространение	Растения, Drosophila, C. elegans. Не найдено у позвоночных	Эукариоты	Эмбриональные клетки животных (начиная с кишечнополостных). Нет у простейших и растений
Длина	21–22 нуклеотидов	19–25 нуклеотидов	24–30 нуклеотидов
Структура	Двуцепочечная, по 19 комплементарных нуклеотидов и два неспаренных нуклеотида на 3’-конце	Одноцепочечная сложная структура	Одноцепочечная сложная структура. U на 5’-конце, 2’-O-метилированный 3’-конец
Процессинг	Dicer-зависимый	Dicer-зависимый	Dicer-независимый
Эндонуклеазы	Ago2	Ago1, Ago2	Ago3, Piwi, Aub
Активность	Деградация комплементарных мРНК, ацетилирование геномной ДНК	Деградация или ингибирование трансляции целевой мРНК	Деградация мРНК, кодирующих МГЭ, регуляция транскрипции МГЭ
Биологическая роль	Антивирусная иммунная защита, подавление активности собственных генов	Регуляция активности генов	Подавление активности МГЭ во время эмбриогенеза

Но как же применить малые РНК на практике? В 2006 году американская фармацевтическая фирма «Sirna» провела клинические испытания первого лекарства, механизм действия которого основан на РНК-интерференции (оно называется «Sirna-027»). Показано, что «Sirna-027» помогает против возрастной макулярной дегенерации сетчатки (macular degeneration) – болезни, которая приводит к потере зрения. Полмиллиона новых случаев этого заболевания регистрируется в мире ежегодно. Болезнь заключается в том, что в центральной части сетчатки неконтролированно растут новые кровеносные сосуды, что приводит к разрушению клеток, воспринимающих свет.

Ученые идентифицировали ген, избыточная активность которого в сетчатке приводит росту кровеносных сосудов. Это ген рецептора эндотелиального фактора роста сосудов – белка, который «воспринимает» гормональный сигнал к росту. В результате, человек слепнет из-за активности своего же «нормального» и «нужного» гена, но в ненужном месте и не «на том» этапе жизни. «Sirna-027» – это специфическая микро-РНК, которая запускает механизм разрушения информационной РНК, обеспечивающей синтез рецептора эндотелиального фактора роста сосудов. Для терапевтического применения микро-РНК была химически модифицирована особым образом (дело в том, что «обычные» РНК, введенные в организм, плохо проникают в клетки и быстро разрушаются).

Сейчас, кроме лечения макулярной дегенерации сетчатки, «Sirna» выполняет программы по раку, гепатитам В и С, диабету, астме, болезни Хантингтона (прогрессирующая дегенерация нервных клеток, приводящая к инвалидности) и облысению (это пока тоже неизлечимая болезнь).

Главная проблема в области клинического применения микро-РНК – не конструирование самих молекул, специфических для определенных генов-мишеней, а их доставка в клетку. В отличие от многих обычных лекарств, молекулы РНК сравнительно большие и обладают физико-химическими свойствами, которые мешают им проходить через внешнюю мембрану клетки. Решением этой проблемы с большим или меньшим успехом занимается целая отрасль современной науки (drug delivery). Существуют две стратегии: во-первых, применение «готовых» систем доставки РНК или ДНК в клетку, получаемых из некоторых вирусов, а во-вторых, создание искусственных конструкций из молекул (например, липосом).

Работы нобелевских лауреатов Файра и Меллоу открыли дорогу к созданию универсального инструмента для целенаправленного вмешательства в проявление наследственных признаков. Инструмента, который не нарушает сами гены и не влияет на передачу генов потомству.

Значит, этические возражения снимаются. В 1-ой половине XX вв. сторонники евгеники в некоторых странах стерилизовали людей с наследственными заболеваниями. В отличие от подобных евгенических подходов, РНК-интерференция открывает перспективы «заглушения» активности нежелательных генов без какого-либо вмешательства в «святая святых» – наследственность.

Список литературы

1. биомолекула: Старокадомский П. «Обо всех РНК на свете, больших и малых»;

2. Спирин А. С. (2001). Биосинтез белков, мир РНК и происхождение жизни.Вестник РАН,71, 320–328;

3. Элементы: «Полные митохондриальные геномы вымерших животных теперь можно извлекать из волос»;

4. Fire A., Xu S., Montgomery M.K., Kostas S.A., Driver S.E., Mello C.C. (1998). Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature,391, 806–311;

5. биомолекула: «МикроРНК впервые обнаружены в одноклеточном организме»;

6. . J. Exp. Med.,205, 585–594;

7. биомолекула: «микроРНК — чем дальше в лес, тем больше дров»;

8. Элементы: «Усложнение организма у древних животных было связано с появлением новых регуляторных молекул»;

9. Grimson A., Srivastava M., Fahey B., Woodcroft B.J., Chiang H.R., King N., Degnan B.M., Rokhsar D.S., Bartel D.P. (2008). Early origins and evolution of microRNAs and Piwi-interacting RNAs in animals. Nature,455, 1193–1197.