4.Проведите диализ при 4°С против двух смен ФСБ (объем по 1 литру) в течение не менее 20 часов.

5.Храните препарат при 4 °С.

5.5.Другие методы

Систему авидин—биотин можно имитировать, присоединяя небольшую молекулу (например, гаптена) к первому антителу и используя в дальнейшем меченые антитела против гаптена. Обычно употребляемые гаптены — динитрофенол (ДНФ) и арсинилат. Данный метод может использоваться для мечения срезов в том случае, когда используются два антитела из животных одного вида (разд. 8).

Описанный выше метод может использоваться в различных комбинациях. Для повышения чувствительности антитела должны быть связаны с другими антителами. Однако, за исключением особых случаев, это не всегда необходимо и часто нежелательно. В том случае, когда антиген явно разрушен при фиксации ткани, его присутствие может быть обнаружено с помощью высокочувствительного метода. Но и тогда повышенная чувствительность будет приводить к появлению слабых перекрестных реакций и усилению неспецифического окрашивания. В любом случае, если только это возможно, предпочтительнее правильно выбирать условия обработки ткани.

6. Экспериментальные методы

Ниже приводятся рабочие прописи для различных методов. Прописи, предлагаемые разными авторами, могут различаться в деталях. Ни один из методов не является самым правильным, и в зависимости от того, какие преследуются цели, в методы могут быть внесены определенные изменения.

В приводимых ниже методах все инкубации и обработки производятся при комнатной температуре, если это не оговорено особо. Во многих лабораториях комнатная температура варьирует от 18° до 24 °С, что приводит к некоторым различиям в скоростях реакций. Поэтому, если требуется стандартизировать условия реакции, особенно в тех случаях, когда производятся количественные измерения, необходимо контролировать температуру. Когда вы пользуетесь холодной комнатой, время инкубации должно быть соответственно увеличено.

Таблица 4.10. Непрямой метод окрашивания

1.Перенесите срезы в воду или в буфер.

2.Если используются конъюгаты с ферментами, то предварительно необходимо подавить эндогенную ферментативную активность.

3.Промойте срезы ФСБ и удалите с помощью фильтровальной бумаги излишек буфера с предметного стекла, чтобы не произошло дополнительного разведения антител на стекле.

4.Нанесите на срез 100 мкл разведенных нужным образом первых антител* и проведите инкубацию в течение 1 часа во влажной камере при комнатной температуре.

5.Промойте срезы ФСБ с 0,5%-ным бычьим сывороточным альбумином (БСА).

6.Промойте несколько раз раствором ФСБ с 0,01% детергента (Brij или Twin 80).

7.Промойте ФСБ и промокните его излишки на стекле.

8.Нанесите на срез 100 мкл вторых правильно разведенных антител (с конъюгатом) и проинкубируйте их в течение 1 часа во влажной камере при комнатной температуре.

9.Повторите этапы 5 и 6.

10.При использовании ферментной метки промойте стекло в соответствующем буфере и проведите цветную реакцию. Заключите препарат под покровное стекло.

* Разведите антитела ФСБ с 0,5% БСА или лучше ФСБ с 5% сыворотки того же вида животного, от которого получены вторые антитела

Недавно было опубликовано сообщение о том, что время инкубации с антителами может быть сокращено с одного часа до одной минуты за счет использования микроволновой печи [9]. Это происходит потому, что при локальном разогреве, который производится в такой печи, скорость реакции антиген — антитело возрастает.

6.1. Общее описание метода

В общем виде метод применения антител на срезах дан в табл. 4.10. Методика приведена для непрямой реакции, но она может быть легко адаптирована для всех других методов, описанных выше. Пропись следует использовать вместе с детальными протоколами, которые приводятся ниже для каждого типа меток.

Необходимость большинства добавок к буферным растворам состоит в том, чтобы с их помощью воспрепятствовать неспецифическому связыванию Ig со срезом, а также удалить остатки непрореагировавших антител после инкубации. Белок добавляется для того, чтобы воспрепятствовать адсорбции антител на

82