2.2 Постановка эксперимента
Эксперимент включал 3 опыта:
Опыт №1. Влияние источника углеродного питания на органогенез данных видов растений в культуре in vitro.
Эксперимент проводили по схеме представленной на рисунке 2.3
Посадка эксплантов на питательную среду
(10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 г/л) сахароза
(10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 г/л) глюкоза
(10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 г/л) фруктоза
Без источника углеродного питания
Перенос в условия культивирования
(круглосуточное освещение, t = 22°C)
Рисунок 2.3 – Схема посадки эксплантов на среду с углеводами
Опыт №2. Влияние различных регуляторов роста на органогенез эксплантов.
Эксперимент проводили по схеме представленной на рисунке 2.4
Посадка эксплантов на питательную среду
(0,1; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0 мг/л) 6-БАП
(10-7, 10-6, 10-5, 10-4, 10-3 10-2 %) Эпин-Экстра
(10-7, 10-6, 10-5, 10-4, 10-3 10-2 %) Рибав-Экстра
Без регуляторов
Перенос в условия культивирования
(круглосуточное освещение, t = 22°C)
Рисунок 2.4 – Схема посадки эксплантов на среду с регуляторами роста
Опыт №3. Перевод стерильных растений цимбидиума и фиалки в условия ex vitro.
Эксперимент проводили по схеме представленной на рисунке 2.5
Растения перед посадкой в условия ex vitro
Обработка
0,1мг/л ИУК
1,0 мг/л ИУК
Без обработки
15 мин
30 мин
15 мин
30 мин
Перенос растений после обработки в почвенный субстрат (круглосуточное освещение, t = 22°C)
Рисунок 2.5 – Схема перевода растений-регенерантов в условия ex vitro
2.3 Методы исследования
2.3.1 Методы стерилизации
Все манипуляции с эксплантами (введение в культуру, пересадка на свежую питательную среду) проводятся в асептическом помещении (ламинар-боксе) стерильными инструментами.
Чистую посуду, предварительно завернутую в бумагу или фольгу, инструменты, бумагу, вату стерилизуют сухим жаром в сушильном шкафу при температуре 160° С в течение 1,5-2 ч. Питательные среды стерилизуют в автоклаве при температуре 120° С и давлении 1-1,75 атм в течение 20 минут. Если в состав питательных сред входят вещества, разрушающиеся при автоклавировании, их следует фильтровать путем фильтрации через бактериальный фильтр. Затем стерильные профильтрованные компоненты добавляют в проавтоклавированную среду, охлажденную до температуры 40 °С [50].
2.3.2 Приготовление питательных сред
В состав питательной среды входят минеральные соли макро- и микроэлементы соли железа, углеводы, витамины, регуляторы роста, агар.
Для приготовления питательной среды готовили маточные растворы макро- и микросолей (таблица 2.1).
В качестве основы среды использовали агаризованную (0,7%) среду по прописи Мурасиге и Скуга (pH = 5,6-5,8), варьируя в опыте №1 источниками углеродного питания (таблица 2.2), а в опыте №2 регуляторами роста (таблица 2.3).
В качестве регуляторов роста брали 6-БАП, ИУК, Эпин-Экстра, Рибав-Экстра в различных концентрациях. Особой тщательности и аккуратности придерживались при приготовлении маточных растворов микросолей и регуляторов роста, так как незначительные ошибки могли сказаться на росте ткани.
Минеральные соли взвешивали в стеклянной таре, микроэлементы, витамины, сахарозы, регуляторы роста – на бумаге калька.
Таблица 2.1 – Состав минеральной основы питательной среды МС
|
Компонент среды |
Количество вещества |
|
|
Маточный раствор макросолей (г на 1 л маточного раствора) |
||
|
KNO3 |
38 |
|
|
NH4NО3 |
33 |
|
|
KH2PO4 |
3,4 |
|
|
MgSO4 . 7H2O или MgSO4 безводный |
7,4 3,6 |
|
|
CaCl2 . 2H2O или CaCl2 безводный |
8,8 6,65 |
|
|
Маточный раствор микросолей (мг на 100 мл маточного раствора) |
||
|
Na2MoO4 . 2H2O |
25 |
|
|
CuSO4 . 5H2O |
2,5 |
|
|
H3BO3 |
620 |
|
|
MnSO4 . 5H2O или MnSO4 . 4H2O |
2410 2230 |
|
|
ZnSO4 . 7H2O |
860 |
|
|
KJ |
83 |
|
|
CoCl2 . 6H2O |
2,5 |
|
|
FeSO4 |
557 |
|
|
Na2 ЭДТА |
745 |
|
|
Компонент |
Количество, на 1 л |
|
макросоли |
50 мл |
|
микросоли |
1 мл |
|
СаCl2 |
50 мл |
|
FeNa2ЭДТА |
5 мл |
|
пиридоксин HCl (В6) |
1 мл |
|
тиамин HCl (В1) |
1 мл |
|
аскорбиновая кислота |
15 мл |
|
сахароза, глюкоза, фруктоза |
варьирует |
|
агар-агар |
7 г |
Таблица 2.2 – Состав среды Мурасиге и Скуга для опыта № 1
Таблица 2.3 – Состав среды Мурасиге и Скуга для опыта №2
|
Компонент |
Количество, на 1 л |
|
макросоли |
50 мл |
|
микросоли |
1 мл |
|
СаCl2 |
50 мл |
|
FeNa2ЭДТА |
5 мл |
|
пиридоксин HCl (В6) |
1 мл |
|
тиамин HCl (В1) |
1 мл |
|
аскорбиновая кислота |
15 мл |
|
6-БАП, Рибав-Экстра, Эпин |
варьирует |
|
сахароза |
30 г |
|
агар-агар |
7 г |
Все компоненты среды готовили на дистиллированной воде. Питательные среды автоклавировали в пробирках при избыточном давлении 1 атм (120 оС) в течение 20 мин.
2.3.3 Работа в ламинар-боксе
Посадку эксплантов на питательную среду проводят в ламинар-боксе. Перед работой ламинар-бокс стерилизуют. Прежде всего, поверхность стола и стен протирают 70-процентным спиртом, затем помещают в ламинар необходимые стерильные инструменты, посуду и сосуд с 70-% спиртом, в котором находится пинцет и другие инструменты, необходимые во время работы. Все доступные поверхности посуды протирают 70-% спиртом.
Включение ламинар-бокса. Включают последовательно: 1 – сеть, 2 –вентиляционную систему, пропускающую воздух через фильтры, 3 – ультрафиолет. Через 20-30 мин ультрафиолет выключают, в течение 20 мин проветривают помещение и приступают к работе. Помещают в ламинар сосуды с растительным материалом. Поверхность сосудов и руки тщательно протирают 70-% спиртом. Зажигают спиртовку. Колбы и баночки, закрытые крышками из фольги, открывают, осторожно разворачивая края фольги, снимают ее и кладут на стол. После проведенной работы, берут пинцет из сосуда со спиртом, обжигают его на пламени спиртовки, обжигают горло сосуда, затем берут пинцетом крышку из фольги, обжигают ее с двух сторон и закрывают горло сосуда. Через некоторое время после охлаждения фольги ее прижимают плотно к горлу сосуда. Пробирки закрывают ватно-марлевыми пробками. Пробирки подписывают (дата, сорт, вариант среды) [50].