2. Матеріали і методи дослідження

Експериментальна частина роботи виконана на базі кафедри мікробіології і вірусології Одеського національного університету імені І. І. Мечникова та Одеського біотехнологічного науково-навчального центру.

Матеріалом для дослідження був штам Bacillus sp. ОНУ 15, отриманий із Колекції морських та практично корисних для екологічної біотехнології культур мікроорганізмів ОНУ імені І. І. Мечникова.

Дослідження проводилося поетапно.

2.1. Визначення життєздатності штаму Bacillus sp. Ону 15

На першому етапі дослідження проводили визначення життєздатності музейної культури Bacillus sp. ОНУ 15, які зберігали за допомогою різних методів:

1. Субкультивування;

2. Під шаром вазелінової олії;

3. Ліофілізації;

4. При низькій температурі (–80 ^оС).

Перші етапи щодо визначення життєздатності культури, що зберігалася різними методами мали свої особливості.

Біомасу культрури, що зберігалася під шаром вазелінової олії, попередньо відбирали за допомогою бактеріальної петлі, та вносили до пробірки з 10 мл фізіологічного розчину, у випадку зберігання за допомогою ліофільного висушування фізіологічний розчин у обсязі 1 мл вносили до ампули з біомасою. У пробірку з музейною культурою, що зберігалася на скошеній поверхні МПА за методом субкультивування, вносили 10 мл стерильного фізіологічного розчину. Культуру, що зберігали при низькій температурі попередньо розморожували при температурі 22 ^оС.

Наступні маніпуляції щодо визначення життєздатності були подібними. Всі отримані суспензії досліджуваної культури доводили до 5 одиниць по стандарту каламутності. Після цього Отримані суспензії методом послідовних розведень доводили до концентрації 10^-5 клітин на мілілітр та висівали у чашки Петрі з поживним середовищем МПА, у обсязі 0,1 мл. Чашки з посівами культивували протягом однієї доби при температурі 28 ^оС. Після культивування проводили підрахунок КУО (колонієутворюючі одиниці) у чашках. Для цього рахували кількість колоній у кожній чашці та використовували спеціальну формулу для підрахунку кількості колонієутворюючих одиниць в 1 мл суспензії:

M = (ā * 10ⁿ) / V, де:

М – кількість колонієутворюючих одиниць у мілілітрі;

ā – середня кількість колоній у всіх чашках;

10ⁿ – ступінь розведення, з якого було зроблено посів;

V – об’єм суспензії культури, яку вносили на чашки з поживним середовищем.

Кожен тест на життєздатність було проведено у трьох повторностях, а отримані дані було статистично оброблено [31].

2.2. Визначення біологічних властивостей та видова ідентифікація

На наступному етапі дослідження вивчали біологічні властивості (морфологічні, культуральні та фізіолого-біохімічні) штаму Bacillus sp. ОНУ 15 необхідні для подальшої ідентифікації цього мікроорганізму до виду. При дослідженні характерних особливостей та ідентифікації штаму Bacillus sp. 15 використовували загальноприйняті мікробіологічні методи та специфічні методики дослідження бактерій роду Bacillus.

Для вивчення морфологічних особливостей проводили світлопільну мікроскопію за допомогою світлового (БІОЛАМ) мікроскопу з використанням імерсійного об’єктиву зі збільшенням у 90 разів. Визначали форму, розміри, рухливість клітин, їх відношення до забарвлення за методом Граму, наявність кристалу токсину.

Для вивченя рухливості бактерій використовувалася мікроскопування за методикою «розчавленої краплини», для чого на предметне скло наносили краплю суспензії живих бактерій та накривали покровним склом.

Розташування спор та токсинів у клітинах та їх вигляд вивчали за допомогою забарвлення бактеріальних клітин розчином метилвіолету на протязі однієй хвилини з подальшим мікроскопуванням [21, 23].

Для вивчення розмірів клітин використовували стандартний мікрометр, вимірюючи клітини у різних областях поля зору мікроскопу. Для отримання адекватних даних щодо розмірів клітин було досліджено 10 клітин, вивчаючи їх довжину та ширину, після розраховували середній показник розмірів клітин досліджуваного штаму.

Далі нами було вивчено культуральні та фізіолого-біохімічні властивості штаму Bacillus sp. ОНУ 15. Для цього було використовано посів на поверхню та в глиб у ряд поживних середовищ, включаючи МПА (м’ясо пептонний агар), МПБ (м’ясо пептонний бульон), КА (кров’яний агар), LB (низкосольове середовище) та модіфікование грибне поживне середовище, яке має у своєму складі грибний відвар гливи та 1,5 % агару. Культивування проводили у трьох температурних режимах: при 22 – 24 ^оС, 28 – 30 ^оС та 37 – 38 ^оС.

Для встановлення біохімічних властивостей було проведено тест на утилізацію дослідним штамом складних речовин. Для цього використовувалися крохмаль, желатин, глікоген, ескулін, глюкоза, мальтоза, фруктоза та рибоза, які додавали до МПА у розмірі 1% від загального об’єму середовища. Візуалізація утилізації речовин була проведена за допомогою додавання до середовищ 1,5 мл індикатору бром-тимолового синього на 100 мл середовища. За умов утилізації речовин індикатор забарвлювався у жовтий колір.

Використовуючи каталазний індикатор та оксидазний тест, було визначено наявність каталазної та оксидазної активності у бактерій експериментального штаму.

Для видової ідентифікації використовували отримані дані щодо морфологічних, культуральних та фізіолого-біохімічних особливостей бактерій досліджуваного штаму Bacillus sp. ОНУ 15 і користуючись дев'ятим виданням визначника бактерій Бергі встановлювали його видову приналежність.