Иммунодефициты с недостаточностью фагоцитоза

Недостаточность фагоцитов составляет 10-15% всех первичных иммунодефицитов. Недостаточность фагоцитов обусловлена нарушением пролиферации, дифференцировки, хемотаксиса нейтрофилов и макрофагов и собственно нарушением процесса фагоцитоза. Выраженная недостаточность полиморфноядерных лейкоцитов (нейтропения) может привести к развитию генерализованной бактериальной инфекции. Особое значение имеют два генетических дефекта, нарушающих функцию фагоцитов, с которыми связано возникновение тяжелых заболеваний, часто с летальным исходом – хронического гранулематоза (причина которого состоит в нарушении механизма восстановления кислорода) и недостаточности адгезии лейкоцитов (обусловленной дефектами в генах интегринов).

Хроническая гранулематозная болезнь

Хроническая гранулематозная болезнь развивается у детей с наследственными дефектами бактерицидной активности фагоцитов (макрофагов и нейтрофилов): утрачивается способность клеток вырабатывать антимикробные метаболиты кислорода и уничтожать каталазаположительные микробы.

Фагоцитированные микробы не уничтожаются, в результате чего развиваются повторные гнойные инфекции кожи, подкожной клетчатки, легких, печени и других органов и тканей. Фагоциты превращаются в «хранилища» для микробов, способствуя хронизации процесса. Скопления клеток образуют гранулемы. Дефект обусловлен недостатком цитохрома b₅₅₈ в мембране фагосомы гранулоцитов. Никотинамиддинуклеотидфосфат (НАДФ) не способен транспортировать электроны, необходимые для образования радикалов кислорода и передавать их молекулам О₂. Дефект НАДФ-оксидазы и недостаток глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы ответственны за неспособность гранулоцитов убивать фагоцитированные бактерии.

Выявление дефекта образования перекисных радикалов с помощью методов люминолзависимой хемилюминесценции и НСТ-теста.

Синдром Чедиака-Хигаси

Синдром Чедиака-Хигаси относится к группе наследственных нарушений функции фагоцитирующих клеток. Это редкое заболевание, при котором нарушается хемотаксис и отсутствует внутриклеточный лизис бактерий.

В нейтрофилах, моноцитах и некоторых других клетках появляются аномально крупные везикулы, лизосомы. Гигантские лизосомы способны к слиянию с фагосомами, но не могут освобождать активные лизосомальные ферменты. Поэтому нарушается процесс разрушения бактерий, фагоцитоз становится неэффективным. Нарушение хемотаксиса обусловлено дисфункцией микротрубочек цитоскелета.

Диагноз синдрома Чедиака-Хигаси устанавливается при обнаружении в мазках крови и костного мозга крупных включений в нейтрофилах разной степени созревания и моноцитах. Включения образуются благодаря слиянию первичных и специфических гранул. Несмотря на высокий уровень в них пероксидазы, нарушение слияния их с фагосомами препятствует завершению фагоцитоза. Наблюдали сохранение активности бактерий спустя 45 минут после их захвата фагоцитами. Нарушен также хемотаксис, что связывают с уменьшением подвижности клеток из-за крупных включений и нарушения структуры микротрубочек, однако взаимодействие микротрубочек и лизосом не нарушено.

Дефицит молекул адгезии лейкоцитов

Первый тип обусловлен дефектом гена β₂-цепи интегринов (CD18), общего для всех молекул интегринов – СD11a/CD18 (LFA-1), CD11b/CD18 (рецептор комплемента - CR3), CD11c/CD18 (рецептор комплемента - C3dg-R). Перечисленные интегрины участвуют в хемотаксисе лейкоцитов, адгезии лейкоцитов к эндотелию сосудов, агрегации нейтрофилов, взаимодействии (адгезии) Т-лимфоцитов с АПК и клетками-мишенями.

Второй тип развивается в результате утраты лейкоцитами способности образовывать молекулы селектинов. Это приводит к нарушению взаимодействий, при которых сиалогликопротеин Sgp50 является лигандом для L-селектина (CD62L) лейкоцита, а сиалил-Levis^x – олигосахарид – лигандом для Е-селектина (CD62E) эндотелиальной клетки. Нарушается взаимодействие гранулоцитов с эндотелиальными клетками. Подавляются роллинг (перекатывание лейкоцитов на активированном эндотелии) и миграция лейкоцитов в очаг инфекции, в результате чего бактерии быстро распространяются по тканям организма.

Отмечается снижение выраженности молекул адгезии на лимфоцитах, моноцитах и гранулоцитах. Лейкоцитоз при первом типе – до 100 000 лейкоцитов в 1 мкл крови. Количество нейтрофилов увеличивается в 5-10 раз.

Дефицит миелопероксидазы

Дефицит миелопероксидазы приводит к снижению эффективности респираторного взрыва в фагоцитах.

В фагоцитах накапливается перекись водорода, которая не является самостоятельным микробоцидным фактором. Такие клетки не в состоянии уничтожать грибы рода Candida. Патология сопровождается хроническими инфекциями.

В норме миелопероксидаза преобразует перекись водорода в ионы OCl^ˉ в специфических гранулах. Дефицит миелопероксидазы вызван существенным снижением количества специфических гранул в гранулоцитах и моноцитах.

Синдром гипериммуноглобулинемии Е

Синдром гипериммуноглобулинемии Е (синдром Джоба) сопровождается нарушением хемотаксиса нейтрофилов, что способствует развитию инфекций.

В результате снижения продукции γ-интерферона Т_Н1-лимфоцитами происходит повышение функций Т_Н2-лимфоцитов и гиперпродукция IgE. Это способствует высвобождению гистамина, который подавляет развитие воспаления и блокирует хемотаксис нейтрофилов.

Для синдрома гипериммуноглобулинемии Е характерны повторные, обычно стафилококковые, «холодные» абсцессы подкожной клетчатки.

Фагоцитоз является важным звеном иммунной системы, его недостаточность – причина развития многих заболеваний. Существует несколько методов для оценки состояния фагоцитоза. Но они имеют ряд ограничений: слабую сопоставимость результатов тестирования, как правило позволяют выявить уже грубые изменения фагоцитарной функции и мало чувствительны к слабым изменениям функций фагоцитов. Поэтому поиск и разработка новых методов оценки фагоцитарной функции являются актуальными и сегодня.

Методы исследования фагоцитарного звена иммунитета

Нейтрофильные гранулоциты являются ключевыми клетками среди факторов противоинфекционной резистентности организма человека. Важнейшим проявлением функциональной активности НГ после воздействия стимулирующих агентов является резкая перестройка кислородзависимого метаболизма, получившая название кислородзависимого, или метаболического, взрыва.

Фагоцитоз является сложным процессом, имеющим несколько стадий.

Поглотительную активность фагоцитов оценивают прямым визуальным подсчетом поглощенных микробов или других частиц внутри МФ, а также по числу частиц, оставшихся непоглощенными, например частиц латекса, с помощью электронного счетчика частиц, эритроцитов по концентрации гемоглобина спектрофотометрически, эмульгированных частиц масляного красного со спектрометрической регистрации или меченных флюоресцеинизотиоцианатом микрококков с помощью флюориметра. Высокая точность и производительность характеризуют метод изучения фагоцитоза флюоресцирующих частиц латекса с помощью автоматического проточного цитофлюориметра.

Прямой визуальный метод

Определение фагоцитарной активности гранулоцитарных клеток является неотъемлемой частью тестов при определении иммунного статуса, поскольку фагоцитоз является одним из главных звеньев неспецифического иммунитета.

Растворы и реактивы.

Для проведения анализа необходимо:

Фиксатор – 1 часть краски Романовского-Гимза и 3 части этилового спирта 96˚. Краска – 1 часть краски Романовского-Гимза и 2 части дистиллированной воды. Взвесь пекарских дрожжей – свежие дрожжи разводят в физ.растворе в соотношении 1:5 и выдерживают на водяной бане в течении 1 часа, охлаждают и хранят в холодильнике. Перед постановкой теста готовят рабочее разведение дрожжей: отмывают дрожжи физ.раствором до получения прозрачной надосадочной жидкости. Из осадка готовят 1% взвесь дрожжей.

Постановка реакции.

1. 50 мкл 1% дрожжей смешивают с 50 мкл гепаринизированной крови в круглодонном иммунологическом планшете, инкубируют в термостате при 37˚С 30 минут.

2. Делают мазок из содержимого лунок планшета. Приготовление мазка – 20 мкл пробы наносят на предметное стекло, равномерно распределяют по всей поверхности, высушивают на воздухе, фиксируют 20 минут и окрашивают.

3. В мазке через 30 минут подсчитывают количество фагоцитирующих нейтрофилов из 100 подсчитанных и количество поглощенных ими объектов.

Учет реакции.

Оценка фагоцитарной активности нейтрофилов осуществляется по трем показателям.

ФП (фагоцитарный показатель) – число фагоцитирующих нейтрофилов на 100 подсчитанных нейтрофилов через 30 минут инкубации.

ФЧ (фагоцитарное число) определяется путем деления количества поглощенных дрожжевых клеток на число «активных» (поглотивших дрожжи) нейтрофилов через 30 минут инкубации, что соответствует среднему числу дрожжевых клеток, поглощенных одним активным нейтрофилом.

КАФ (коэффициент активных фагоцитов) – интегральный показатель активности фагоцитарной системы, выражающийся в абсолютном количестве фагоцитирующих нейтрофилов, рассчитывается, исходя из общего количества лейкоцитов, % содержания нейтрофилов и ФП.

НСТ-тест

Для оценки уровня активности МФ используется полярографический метод (потребление кислорода), НСТ-тест (восстановление нитросинего тетразолия), йодирование (переход радиоактивного меченого йода в кислотонерастворимый осадок), окисление глюкозы (образование молекул 14СО₂ при окислении глюкозы-1-14С). Данные тесты основаны на том, что активация МФ сопровождается кислородзависимым метаболическим “взрывом”. Классическим из данных методов стал НСТ-тест. Дело в том, что активированные фагоциты способны поглощать нитросиний тетразолий (НСТ) и восстанавливать его в формазан. НСТ-тест позволяет дифференцировать активированные и интактные фагоциты, но его нельзя считать количественным, так как визуальная оценка результатов субъективна.

Проведение теста НСТ во многих случаях помогает оценить бактерицидные кислородзависимые системы нейтрофильных гранулоцитов. Этот тест ставился в двух вариантах – спонтанном и стимулированном, что позволило оценить не только спонтанную активность полиморфноядерных лейкоцитов, но и способность их стимулироваться, что не маловажно в диагностике первичных и вторичных иммунодефицитов.

Реактивы и их приготовление.

НСТ – 9 мг порошка растворяют в 12 мл дистиллированной воды. Пирогенал – 1 мл пирогенала (25 мг/мл) разводят в 3 мл физ. раствора. Спирт-формалин (1 часть 40% формалина + 9 частей 96% спирта) используется в качестве фиксатора. Нейтральный красный – 100 мг растворяют в 100 мл физ.раствора.

Постановка реакции.

1. В конические пробирки (1,2) добавляют

1. 0,1 мл физ. раствора и 0,1 мл крови с гепарином, перемешать

2. 1 мл пирогенала и 0,1 мл крови с гепарином, перемешать

2. Инкубировать 30 минут при 37˚С

3. В каждую пробирку добавить 0,1 мл НСТ

4. Инкубировать 10 минут при 37˚С

5. Добавить 0,2 мл 20% раствора формалина

6. Через 3 минуты добавить 3 мл дистиллированной воды и в течение 20 секунд интенсивно перемешать

7. Добавить 1 мл 3,4% NaCl

8. Отцентрифугировать 15 минут при 1500об/мин

9. Надосадок слить, из осадка сделать мазок на предметном стекле

10. Мазок высушить на воздухе, зафиксировать смесью спирт-формалин в течение 30 минут, промыть дистиллированной водой, окрасить нейтральным красным в течение 35-45 минут, промыть дистиллированной водой.

Учет реакции проводится при подсчете 100 нейтрофилов.

Вычисляли % клеток, содержащих включения диформазана в виде гранул или сплошных отложений.

А так же вычисляли индекс стимуляции.

ИС =	% положительных клеток в индуцированном НСТ-тесте
	% положительных клеток в спонтанном НСТ-тесте

Метод проточной цитофлюориметрии

Использование проточной цитофлюориметрии позволяет проводить оценку двух параметров фагоцитоза: процента фагоцитирующих НГ и средней интенсивности флюоресценции НГ, коррелирующей с индексом фагоцитоза. Возможность использования цельной крови и малый объем образца (100 мкл) для цитофлюорометрического анализа фагоцитоза представляют собой особую ценность для педиатрической практики. Неоспоримыми преимуществами оценки фагоцитоза методом проточной цитофлюориметрии являются быстрота, объективность, высокая пропускная способность, что позволяет использовать его для массового скрининга иммунного статуса.

ХЛ метод оценки бактерицидной способности фагоцитов

Также для определения бактерицидной способности фагоцитов используется хемилюминесцентный метод, предложенный сравнительно недавно.

Немаловажным аспектом ХЛ-анализа является качество подготовки суспензии фагоцитов. Известно, что ХЛ ответ крови определяется в основном фагоцитирующими клетками: нейтрофилами, моноцитами и макрофагами, способными продуцировать АФК (супероксидный радикал (О₂^-), перекись водорода (Н₂О₂), гидроксильный радикал (ОН) и др.). Наибольший уровень АФК определяется, прежде всего, нейтрофилами. ХЛ анализ проб цельной крови следует проводить в течение двух часов после забора крови. Для хранения крови необходимо использование пробирок из полиэтилена, что препятствует адгезии гранулоцитов на стенки пробирок, которая повышает активацию клеток. При регистрации ХЛ нейтрофилов крови рекомендуется использовать конечную концентрацию люминола от 10^-5 до 10^-4 М. Для устранения нежелательных примесей, влияющих на показатели ХЛ-реакции ПМЯЛ, достаточно одной отмывки клеток раствором Хенкса. При этом обеспечивается достаточное сохранение жизнеспособности клеток. Как известно, фагоцитоз нейтрофилами и макрофагами сопровождается генерацией активных форм кислорода (О₂-, Н₂О₂, ОН-), что сопровождается сверхслабым свечением – хемилюминесценцией. Последняя пропорциональна интенсивности генерации фагоцитами активных форм кислорода и может служить косвенным критерием их фагоцитарной способности, тем более что образуемые продукты обладают выраженными бактерицидными свойствами. Интенсивность ХЛ нейтрофилов обычно составляет менее 1 фотона в 1 секунду на клетку. Для повышения интенсивности ХЛ-свечения нейтрофилов используют активаторы ХЛ – люминофоры. Используют такие люминесцирующие химические реагенты, как люминол (5-амино-2,3-дигидро-1,4-фталоазинодион), люцигенин, а также различные аналоги люминола (3-12-диамино-винил)-фталгидрозид, бензолфталазин-1,4(2Н, 3Н)-дион и др. В последнее время, по данным литературы для изучения фагоцитарной активности лейкоцитов используют именно люминолзависимую ХЛ. Выбор люминола в качестве активатора свечения нейтрофилов основан на его высокой активности (свечение клеток в присутствии люминола усиливается в 10³-10⁴ раз), относительно низкой стоимости, стабильности и нетоксичности реактива. Среди методов, регистрация хемилюминесценции является наиболее чувствительным и информативным методом функциональной оценки фагоцитирующих клеток, но вместе с тем и одним из наиболее сложных, не столько в методическом плане, сколько в понимании природы биохимических и физических процессов, которые приводят к излучению света. Механизмы, лежащие в основе ХЛ фагоцитов, сложны и недостаточно изучены. Свечение может возникать в реакции O₂+O₁=2O₂+hν, важную роль могут играть радикалы ОН-. Анализ различных ингибиторов свечения приводит к мысли, что синглетный кислород, гидроксильный радикал и перекись водорода вовлечены в процесс ХЛ. ХЛ фагоцитирующих клеток значительно усиливается в присутствии люминола или люцигенина. Предложено много методов регистрации ХЛ фагоцитарных клеток, эти методы можно разделить на 2 основных класса.

• Регистрация собственной ХЛ. Усиление собственной ХЛ фагоцитирующих клеток наблюдается при стимуляции опсонизированным зимозаном, бактериями, частицами латекса. Собственная ХЛ клеток имеет низкую интенсивность и лежит в широком спектральном диапазоне с максимумом в области 400 – 500 нм. Регистрация ХЛ требует высокой чувствительности прибора и достаточного количества выделения клеток (обычно не менее 10⁶ клеток). Эритроциты, гемоглобин, сыворотка крови ингибируют ХЛ.

• ХЛ в присутствии люминола. Свечение имеет на 2 – 3 порядка большую интенсивность, чем собственная ХЛ. Усиление ХЛ наблюдается при действии зимозана, бактерий, частиц латекса, комплексов антиген – антитело, ионофора кальция, хемотаксических пептидов. ХЛ может наблюдаться в суспензии как выделенных, клеток, так и клеток в сыворотке крови.

Таким образом, хемилюминесцентный метод позволяет проводить быструю количественную оценку фагоцитарной и бактерицидной активности клеток. Он может использоваться при исследовании малых количеств биологического материала крови, или может служить как для оценки состояния клеток, так и для оценки опсонической активности сыворотки и влияния лекарственных препаратов.

ХЛ метод позволяет определить бактерицидную способность фагоцитов. Данный тест ставился в двух вариантах – спонтанном и стимулированном. Спонтанный тест позволяет оценить состояние кислородзависимого механизма бактерицидности гранулоцитов. Стимулированный тест позволяет оценить функциональный резерв кислородзависимого механизма бактерицидности гранулоцитов.

Реактивы и их приготовление.

3% желатин (AppliChem) – к 0,6 г желатина прибавляем 20 мл PBS, нагреваем на водяной бане до полного растворения.

Опсонизированный зимозан А (Sigma). Зимозан опсонизируют донорской сывороткой:

• 100 мг зимозана растворяем 5 мл донорской сыворотки

• помещаем в термостатируемый шейкер на 1 час при 37°С

• центрифугируем 1500 об/мин – 10 мин

• надосадок аккуратно пипеткой сливаем

• 3 раза отмываем раствором PBS

• разводим в 5 мл PBS

Замораживаем.

В качестве донорской используем сливную сыворотку.

Люминол (Sigma)

• 10 мг люминола растворить в 100 мл раствора PBS

выдержать в течение 18 часов раствор в холодильнике

• перемешиваем на шейкере в течение 1 часа

• отфильтровываем через бумажный фильтр

Замораживаем.

Повторному замораживанию ни зимозан, ни люминол не подвергать.

PBS (Sigma) – 1 таблетка PBS на 100 мл физиологического раствора.

Выделение нейтрофилов.

Кровь собирают в стеклянные пробирки (200 мкл гепарина + 2 мл крови)

• 2 мл крови : 1 мл 3% желатина (слегка перемешать пипеткой)

• в термостат на 10-20 мин при 37°С

параллельно с пробирками с кровью ставим пробирки с PBS (по 2 мл) для поддержания в них необходимой температуры

• в термостате происходит расслоение

собираем верхний слой (сколько будет) и помещаем в пробирки с PBS

• центрифугируем 10 мин при 1000 об/мин

• надосадок сливаем (через край пробирки)

• осадок аккуратно перемешиваем пипеткой

Необходимо чтобы в пробе было 2млн клеток.

Рассчитываем кол-во PBS, которым необходимо ресуспендировать взвесь лейкоцитов для получения 2млн клеток, при условии, что при выделении теряется около 50% клеток.

Расчет ведем по выведенной формуле:

Vмл = 0,25*кол-во лейкоцитов крови*NE(%)*Vкрови, идущей на выделение.

Постановка реакции.

В лунки:

• в каждую по 100 мкл пробы

• во второй ряд планшета по 10 мкл опсонизированного зимозана

Планшет помещаем в термостат на 2-3 минуты при 37ºС, а также, параллельно с планшетом пробирки с люминолом.

• в каждую по 100 мкл люминола

Регистрация хемилюминесценции фагоцитов была проведена на многорежимном детекторе Anthos Zenyth 1100 в непрозрачном стриппированном по 12 лунок планшете для люминесцентных анализов. Измерение люминесценции проводилось 10 раз через каждые 138 секунд.

Учет реакции.

Уровни спонтанной и стимулированной активности нейтрофилов учитываем по максимальному значению ХЛ свечения. А так же рассчитываем коэффициент стимуляции.

КС = СтАН / СпАН.

Список использованной литературы

1. Воробьев А.А., Быков А.С., Караулов А.В. Иммунология и аллергология: Практическая медицина, 2006г. – 288с.: ил.

2. Галактионов В.Г. Иммунология: – 3-е издание, исправленное и дополненное – М.: «Академия», 2004. – 528 с.

3. Долгушин И.И., Бухарин О.В. Нейтрофилы и гомеостаз. – Екатеринбург: изд-во УРО РАН, 2001. – 277 с.

4. Кишкун А.А. Руководство по лабораторным методам диагностики. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2007. – 800 с.

5. Козлова С.И., Демикова Н.С.. Семанова Е., Блинникова О.Е. Наследственные синдромы и медико-генетическое консультирование. – М., 1996. – С. 311.

6. Лифшиц В.М., Сидельникова В.И. «Лабораторные тесты при заболеваниях человека». Справочник для врачей. – М., «Триада-Х», 2003. – 352с.

7. Маршалл В.Дж. Клиническая биохимия: Пер. с англ. – М.; СПб.: БИНОМ; Невский Диалект; 2000. – 368с.

8. Маянский А.Н. Лекции по иммунологии. – Нижний Новгород: изд-во НГМА, 2003. – 272 с.

9. Маянский А.Н. Фагоцитоз: проблемы и перспективы Нижегородский медицинский институт; Вестник РАМН – 1993, №4, с.52-55.

10. Маянский А.Н., Пикуза О.И. Клинические аспекты фагоцитоза. – Казань, 1993.

11. Новиков К.Н. Роль активных форм кислорода в биологических системах при воздействии факторов окружающей среды. // Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук. – 2004.

12. Пикуза О.И., Маянский А.Н. Клинические перспективы изучения фагоцитоза. – Казанский медицинский журнал, 1993, - №3 с.193-196.

13. Пинегин Б.В., Ярилин А.А., Симонова А.В., Климова С.В., Мазуров Д.В., Дамбаева С.В., Бахус Г.О. Пособие для врачей-лаборантов. М.: ГНЦ РФ – Институт Иммунологии Минздрава РФ, 2001.

14. Хаитов Р.М. Физиология иммунной системы. – М: Медицина, 2001. – 223 с.

15. Шиффман Фред Дж. Патофизиология крови: Пер. с англ. – М.; СПб., 2000.

16. Borg V. Zepelin M, Schuff-Werner P «Chemiluminescence of polymorphonuclear granulocytes in the presence of selected candida species». – 1994. – p.121-129

17. Lojek A., Kubala L., Cizova H., Ciz M. // Luminescence, 14: 1-4, 2002.

18. Miyagawa, B. & H.-G. Klingemann.. Phagocytosis and burst activity of granulocytes and monocytes after stem cell transplantation. J. Lab. Clin. Med. – 1997.

19. Pavelkova M., Kubala L. // Luminescence, 19: 37-42, 2004.

20