2.6 Количественное определение суммы проантоцианидинов

Действие проантоцианидинов обусловлено их способностью связывать свободные радикалы (активные биомолекулы, уменьшать интенсивность окислительных процессов в организме. Замедляют процессы старения и износа клеточных мембран и самих клеток, а следовательно и всего организма в целом; повышают устойчивость к воздействию радиации и других вредных факторов внешней среды, усиливают иммунитет, нормализуют функции сердечнососудистой и нервной систем, обладают анитиканцерогенным действием, что препятствует развитию рака; оказывают выраженный косметический эффект. Проантоцианидины легко проникают через гематоэнцефалический барьер, осуществляя защиту и восстановление клеток мозга [27].

К 0,1мл полученного извлечения прибавляли 0,1 мл железосодержащего реактива (2% раствор FeNH₄(S0₄)₂ в 1 н кислоте хлористоводородной) и 2,8 мл 5% раствора кислоты хлористоводородной в н-бутаноле. Флакон с полученным раствором закрывали пробкой и нагревали на кипящей водяной бане в течение 1 часа. После охлаждения измеряли оптическую плотность при длине волны 550 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм, используя в качестве раствора сравнения такой же раствор без нагревания.

Содержание суммы проантоцианидинов в процентах (X) в абсолютно сухом сырье вычисляли по формуле:

А – оптическая плотность исследуемого раствора;

- удельный показатель поглощения цианидин-хлорида, равный 136;

V1 – объем экстракта, мл;

V2 – объем раствора для спектрофотометрирования, мл;

V3 – объем экстракта, взятый для определения, мл;

m – масса сырья в граммах;

W – потеря в массе при высушивании сырья в процентах.

2.7 Определение тбк-реагирующих соединений

Различные токсиканты, в том числе тяжелые металлы, могут вызывать окислительный стресс у растений, стимулируя образование в клетках активных форм кислорода (АФК). Супероксидный радикал (О₂^.-),пероксид водорода (Н₂О₂) и гидроксильный радикал (НО^.) обладают очень высокой агрессивностью и способны повреждать практически все компоненты клетки. Активные радикалы, главным образом НО^., взаимодействуя с органическими веществами, образуют гидропероксиды ДНК, белков, липидов (ROOH). Гидропероксиды, также как и пероксиды, химически активны и в ходе метаболизма переходят в спирты, альдегиды, эпоксиды и другие окисленные соединения. Образование ROOH называют перекисным окислением. В липидах в основном в полиненасыщенных жирных кислотах АФК вызывают цепные реакции с накоплением липидных (L^.), пероксильных (LOO^.), алкоксильных (L0^.) и других радикалов. Участие тяжелых металлов с переменной валентностью, таких как медь, железо, кобальт и др. приводит к разветвлению этой цепи. Перекисное окисление липидов является индикаторной реакцией повреждения клеточных мембран. В результате ПОЛ образуются конечные метаболиты (малоновый диальдегид, этан, пентан и др.), реагирующие с тиобарбитуровой кислотой (ТБК-реагирующих продуктов) [39].

Приготовление реакционной среды:

В 100 мл дистиллированной воды растворяли 10 г трихлоруксусной кислоты и 250 мг тиобарбитуровой кислоты.

Ход определения. Растительный материал (300 мг сырых листьев) растирали в ступке с небольшим количеством реакционной смеси, состоящей из 0,25% раствора тиобарбитуровой кислоты (ТБК) в 10% растворе трихлоруксусной кислоты (ТХУ). Для лучшего растирания добавляли стеклянный песок. Гомогенат переносили в мерную пробирку и доводили объем реакционной средой до 4 мл. Пробы перемешивали и помещали в нагретую до 95°С водяную баню на 30 мин. Затем пробы резко охлаждали, помещая в сосуд с холодной водой. Содержимое проб переносили в центрифужные пробирки и центрифугировали 10 мин при 10000 об/мин. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре СФ-2000 при λ = 532 нм и 600 нм против контроля, содержащего 0,25% раствор ТБК в 10% растворе ТХУ. Концентрацию ТБК-реагирующих соединений рассчитывали с учетом коэффициента экстинкции 155 мМ^-1 см^-1.

А (ммоль/г ) = (λ₅₃₂-λ₆₀₀)/(155*0,3)