1. Дегидрирование - отщепление от субстрата атомов водорода:

Н-S-H -2H ------ S (где S - субстрат)

2. Присоединение к веществу кислорода (одного атома или двух):

S + O ------SO SO₂ (где S - субстрат)

Окисление органических веществ в клетках, сопровождающееся потреблением кислорода и синтезом воды, называют тканевым дыханием,

Углеводы, жирные кислоты и большинство аминокислот окисляются в конечном счёте через цикл лимонной кислоты до СО₂ и Н₂О, но прежде, их углеродный скелет превращается в двухуглеродный фрагмент ацетил-КоА. Главным источником ацетил-КоА служит пировиноградная кислота, образующаяся в реакциях катаболизма глюкозы и некоторых аминокислот.

Окислительное декарбоксилирование пирувата

Окислительное декарбоксилирование пирувата происходит в матриксе митохондрий. Транспорт пирувата в митохондриальный матрикс через внутреннюю мембрану митохондрий осуществляется при участии специального белка-переносчика по механизму симпорта с Н⁺:

Превращение пирувата в ацетил-КоА описывают следующим суммарным уравнением. Реакция необратима, поскольку ΔG^0' = -33,5 кДж/моль.

СН₃-СО-СООН + NAD⁺ + HSKoA → CH3-CO ∼SKoA + NADH + H⁺ + CO₂

Строение пируватдегидрогеназного комплекса

Процесс окислительного декарбоксилирования пирувата катализирует сложноорганизованный пируватдегидрогеназный комплекс, состоящий из 3 ферментов:

- пируватдекарбоксилаза (Е₁),

- дигидролипоилтрансацетилаза (Е₂),

- дигидролипоилдегидрогеназа (Е₃),

а также 5 коферментов: тиаминдифосфат (ТДФ), липоевая кислота, FAD, NAD⁺ и КоА. Кроме того, в состав комплекса входят регуляторные субъединицы: протеинкиназа и фосфопротеинфосфатаза.

Последовательность реакций, катализируемых ПДК, включает 5 стадий:

I - Е₁ катализирует декарбоксилирование пирувата и перенос С₂-фрагмента на ТДФ;

II - Е₂ катализирует окисление гидроксиэтильной группы и перенос С₂-фрагмента на липоевую кислоту (ЛК);

III - ацетилированная дигидролипоилтрансацетилаза взаимодействует с КоА с образованием восстановленной формы липоевой кислоты и ацетил-КоА;

IV - окисленная форма трансацетилазы Е₂ регенерируется при участии E₃;

V - окисленная форма Е₃ регенерируется при участии NAD⁺.

Пируватдегидрогеназный комплекс (ПДК) млекопитающих

Фермент		Число мономеров	Кофермент	Витамин
1. Пируватдекарбоксилаза (пируватдегидрогеназа)	E1	120 (30 тетрамеров)	ТДФ	B1
2. Дигидролипоилтрансацетилаза	Е2	180(60тримеров)	Липоамид	Липоевая кислота (ЛК)
			KoA	Пантотеновая кислота
3. Дигидролипоилдегидрогеназа	Е3	12 (6 димеров)	FAD NAD^+	В2 РР

В центре комплекса располагается дигидролипоилтрансацетилаза (Е₂), образуя его ядро. К дигидролипоилтрансацетилазе присоединены молекулы: пируватдекарбоксилазы (Е₁) и дигидролипоилдегидрогеназы (Е₃).

Пируватдекарбоксилаза содержит прочно связанный с белковой частью ТДФ, а дигидролипоилдегидрогеназа - FAD.

Липоиллизиновые группы центрального фермента (Е₂) функционируют как поворотные "кронштейны", переносящие атомы водорода и ацетильные группы от одной ферментной молекулы комплекса к другой.

Окислительное декарбоксилирование пирувата

Превращение пирувата в ацетил-КоА

Стадия I. Реакция декарбоксилирования пирувата.

Значение декарбоксилирования пирувата в отношении извлечения энергии из мо­лекулы исключительно велико. Три углеродных атома пирувата имеют разную степень окисления. Углерод метильной группы (-СНз) не окислен и, следователь­но, в дальнейшем при его окислении можно получить полезную энергию. Углерод кето-группы (>С=О) окислен частично. При его дальнейшем окислении можно также извлечь некоторое количество дополнительной энергии. А углерод карбок­сильной группы окислен почти полностью. Поэтому карбоксильная группа - это до некоторой степени балластная часть молекулы с позиции извлечения энергии. Её необходимо удалить. Удаление карбоксильной группы (т.е. реакцию декарбокси­лирования) катализирует фермент пируватдегидрогеназа, в активном центре кото­рого локализован тиаминдифосфат - кофермент декарбоксилирования.

Пируват + Е₁-ТДФ → Гидроксиэтил-ТДФ + CO₂.

Тиаминдифосфат (ТДФ) и гидроксиэтил-ТДФ. Рабочей частью ТДФ служит тиазоповое кольцо, к которому присоединяется продукт декарбоксилирования пирувата - гидроксиэтил. В активном центре фермента происходит прямое взаимодействие двух атомов углерода с образованием между ними ковалентной связи. Это взаимодействие обусловлено частичными разноименными зарядами, которыми обладают углерод кето-группы пирувата с одной стороны и атом углерода тиазолового кольца тиаминпирофосфата с другой.

2. На этой стадии E₁ (пируватдегидрогеназа) переносит атом водорода и двухуг- леролеродный ацетильный фрагмент (СН₃-СО-) на молекулу липоевой кислоты, локализованную в активном центре фермента Е₂ (дигидролипоамидацетилтранс- феразы). При этом в активном центре фермента образуется ацетилтиоэфир липое­ вой кислоты.

3. В этой реакции KoA-SH атакует тиоэфирную связь в активном центре фермента Е₂, разрывает её и присоединяет к себе двухуглеролеродный ацетильный фрагмент (СНз-СО-). Происходит образование ацетил~КоА, который покидает актив­ный центр фермента Е₂ (дигидролипоамидацетилтрансферазы). При этом оба ато­ма серы липоевой кислоты полностью восстановлены.

4. В этой реакции фермент Е₃ (дигидролипоамиддегидрогеназа) катализирует

пе­ренос двух атомов водорода с восстановленной липоевой кислоты, находящейся в активном центре фермента Е₂ на кофермент ФАД, локализованный в своём актив­ ном центре. При этом в активном центре фермента Е₃ образуется ФАДН₂.

2. В активный центр дегидрогеназы (Е₃) пируватдегидрогеназного комплекса входит НАД⁺ и присоединяет к себе 2 электрона и протон от кофермента ФАДН₂ и в форме НАДН переносит их в процесс окислительного фосфорилирования.

Связь окислительного декарбоксилирования пирувата с процессом окисли­тельного фосфорилирования

При превращении пирувата в ацетил-КоА происходит образование НАДН, транс­портирующего электроны в дыхательную цепь. Из пары высокоэнергетических электронов в процессе окислительного фосфорилирования может синтезироваться до 3 молекул АТФ. Усиление распада АТФ в клетке ведет к повышению концен­трации АДФ и ускорению окисления НАДН в дыхательной цепи. Повышение концентрации НАД⁺, в свою очередь, стимулирует окислительное декарбоксили-рование пирувата. Напротив, повышение концентрации АТФ и НАДН снижает скорость этого процесса.

Таким образом, изменения отношений АДФ/АТФ и НАДН/НАД⁺ - важнейшие внутриклеточные регуляторные сигналы, отражающие энергетические потребно­сти клетки и регулирующие скорость окислительного декарбоксилирования пиру­вата. Каталитическая активность пируватдегидрогеназного комплекса снижается, когда в клетках имеется достаточно "топлива" в виде жирных кислот и аце-тил~КоА.

Структурное объединение 3 видов ферментов создаёт возможности для координации отдельных этапов сложной ферментативной реакции. Все промежуточные продукты реакции окислительного декарбоксилирования пирувата прочно связаны с комплексом, что увеличивает суммарную скорость процесса и сводит к минимуму побочные реакции.

Пируватдегидрогеназный комплекс, как и все белки, участвующие в реакциях ЦТК, кодируется ядерной ДНК. Транспорт субъединиц ПДК в митохондрии происходит сложным путём за счёт энергии АТФ или трансмембранного электрохимического потенциала при участии белков теплового шока (или шапперонов), предотвращающих их преждевременный фолдинг до поступления в митохондриальный матрикс или внутреннюю мембрану митохондрий.

.

Регуляция пируватдегидрогеназного комплекса

Регуляция пируватдегидрогеназного комплекса (ПДК) имеет важное значение для обеспечения цикла трикарбоновых кислот "топливными" молекулами ацетил-КоА. Точная регуляция этого комплекса имеет важное значение в связи с невоз­можностью обратного преобразования ацетил-КоА в пируват, т.к. ферменты, не­обходимые для этого в организме человека отсутствуют.

Активность ПДК регулируется различными способами:

- доступностью субстратов,

- ингибированием продуктами реакции,

- аллостерическим путём,

- путём ковалентной модификации.

Регуляция активности пируватдегидрогеназного комплекса (ПДК)

Активность пируватдегидрогеназного комплекса увеличивается при повышении концентрации АДФ, внутриклеточного кальция, под влиянием гормонов: инсули­на и адреналина.

При повышении концентрации АДФ ПДК находится в нефосфорилированной ак­тивной форме. Этот эффект усиливается при повышении концентрации внутри­клеточного кальция, который активирует фосфатазу ПДК. Такой механизм акти­вации ПДК особенно важен в мышцах и жировой ткани. Активация ПДК проис­ходит также под влиянием инсулина. Один из эффектов инсулина - повышение концентрации внутримитохондриального кальция, это приводит к активированию ПДК. В клетках миокарда ПДК активируется адреналином.

Фермент фосфатаза, активируясь ионами кальция или инсулином, отщепляет фосфат и активирует пируватдегидрогеназу:

Таким образом, работа пируватдегидрогеназы подавляется при избытке в митохондрии (в клетке) АТФ и НАДН, что позволяет снизить окисление пирувата и, следовательно, глюкозы, в случае когда энергии достаточно.

Если АТФ мало или имеется влияние инсулина, то образуется ацетил-SКоА. Последний в зависимости от условий будет направляться либо в цикл трикарбоновых кислот с образованием энергии АТФ, либо на синтез холестерина и жирных кислот.

Сущность образования восстановленных НАДН и ФАДН₂

Молекулы НАДН и ФАДН₂, образуемые в реакциях окисления углеводов, жирных кислот, спиртов и аминокислот, далее поступают в митохондрии, где ферментами дыхательной цепи осуществляется процесс окислительного фосфорилирования.

Окислительное фосфорилирование

Окислительное фосфорилирование – это многоэтапный процесс, происходящий во внутренней мембране митохондрий и заключающийся в окислении восстановленных эквивалентов (НАДН и ФАДН₂) ферментами дыхательной цепи и сопровождающийся синтезом АТФ.

Впервые механизм окислительного фосфорилирования был предложен Питером Митчеллом (хемиосмотическая теория): перенос электронов, происходящий на внутренней митохондриальной мембране, вызывает выкачивание ионов Н⁺ из матрикса митохондрий в межмембранное пространство, что создает градиент концентрации ионов Н⁺. Н⁺ в норме способны возвращаться в матрикс митохондрий только одним способом – через специальный фермент, образующий АТФ – АТФ-синтазу.

Внутренняя митохондриальная мембрана содержит ряд мультиферментных комплексов, включающих множество ферментов. Эти ферменты называют дыхательными ферментами, а последовательность их расположения в мембране – дыхательной цепью.

Принцип работы дыхательной цепи

В целом работа дыхательной цепи заключается в следующем:

1. Образующиеся в реакциях катаболизма НАДН и ФАДН₂ передают атомы водорода (т.е. протоны водорода и электроны) на ферменты дыхательной цепи.

2. Электроны движутся по ферментам дыхательной цепи и теряют энергию.

3. Эта энергия используется на выкачивание протонов Н⁺ из матрикса в межмембранное пространство.

4. В конце дыхательной цепи электроны попадают на кислород и восстанавливают его до воды.

5. Протоны Н⁺ стремятся обратно в матрикс и проходят через АТФ-синтазу.

6. При этом они теряют энергию, которая используется для синтеза АТФ.

Общий принцип окислительного фосфорилирования

Восстановленные формы НАД и ФАД окисляются ферментами дыхательной цепи, благодаря этому происходит присоединение фосфата к АДФ, т.е. фосфорилирование. Поэтому весь процесс целиком получил название окислительное фосфорилирование.