Криоэлектронная микроскопия.

Аналог метода замороженных срезов в световой микроскопии – изучение образцов в электронном микроскопе без фиксации и химической обработки. Идея криоэлектронной микроскопии изначально появилась как противопоставление рентгеноструктурному анализу белков – убрать повреждение молекул рентгеновским излучением. В начале 80-х годов проводились исследования по получению витрифицированной формы льда с помощью разных устройств, и в 1982 г. появилась первая статья (Jacques Dubochet с соавт.) с фотографиями аденовируса в слое витрифицированной воды. Затем последовало совершенствование метода, который стал воспроизводимым и доступным при наличии достаточного финансирования для покупки соответствующего оборужования.

Процесс подготовки образцов для криоэлектронной микроскопии должен обеспечивать сохранность нативной структуры макромолекул в водной среде, а сам процесс исследования образцов в микроскопе – устойчивость к воздействию электронного пучка и вакуума.

Образцы для криоэлектронной микроскопии готовят в водной среде (суспензии вирусов, бактерий, мелких клеток, макромолекул), наносят на сеточку и быстро замораживают, обычно в жидком этане, при температуре жидкого азота или близко к ней. Замороженный образец толщиной не более 500 нм помещают в колонну электронного микроскопа, к образцу подводят охлаждение жидким азотом. Получаемые изображения не очень высокого качества.

Другой вариант - приготовление срезов, для чего образец толщиной до десятков мкм либо замораживают в охлажденном до температуры жидкого азота этане, либо в установках замораживания под высоким давлением. Замораживание при высоком давлении позволяет получать образцы до 200 мкм толщиной без кристаллизации льда и без применения криопротектантов. Полученные образцы режут на криоультратоме, срезы помещают на сеточки и изучают в микроскопе.

Срезы для криомикроскопии не контрастируют, соответственно, изображение на экране имеет очень низкий контраст. Для его повышения используют различные технические приспособления, в частности, фильтры, отсекающие электроны с той или иной энергией. Для исследования криосрезов используют электронные микроскопы с ускоряющим напряжением 200 кВ и выше.

Производители предлагают различные устройства для подготовки образцов для криоэлектронной микроскопии, выпускаются электронные микроскопы для изучения структур именно этим методом. Наиболее интересные результаты получают при сочетании криоэлектронной микроскопии с томографией (см. ниже).

Криоэлектронная микроскопия в целом является мощным инструментом изучения нативной структуры мелких биологических объектов.

Электронно-микроскопическая томография

Метод ЭМ томографии, разработанный сравнительно недавно, прочно вошел в практику структурных исследований биологических объектов. В его основе лежит известный метод послойной томографии, когда реконструкция трехмерного изображения проводится на основе последовательных рентгеновских снимков, сделанных с неподвижного объекта. В ЭМ-томографии поворачивается объект, на который пучок электронов падает под разным углом. Поворот объекта (сеточки с образцом) осуществляется с помощью гониометра, конструкция которого должна надежно обеспечивать поворот образца на строго фиксированный угол, обычно – 0,5-1 градус. После каждого поворота делается снимок с помощью цифровой камеры. После полной серии поворотов образца (диапазон до 140^о) производится трехмерная реконструкция с помощью компьютерной программы, - очень важный этап. Реконструкция трехмерного изображения в ЭМ-томографии представляет собой более сложную задачу, чем в обычной томографии, поскольку первичные «срезы» получаются под углом.

ЭМ-томографию делают для разных типов объектов. Наиболее «продуктивным» метод оказался для изучения трехмерной организации макромолекул, в частности, белков, для которых невозможно получить кристаллы для рентгеноструктурного исследования. Сочетание ЭМ-томографии с криоЭМ позволяет получать трехмерную реконструкцию нативных объектов, что очень важно.