49 Лабораторные оценки в-звена иммунитета Показатели, Нормы.

Модификация метода розеткообразования (ЕАС – розетки) исследуются для идентификации В-клеток. На поверхности Вл имеются рецепторы для С3-компонента. Для выявления этого рецептора лимфоциты смешивают с эритроцитами барана, обработанными антиэритроцитарными кроличьими антителами в субагглютинирующей концентрации и комплементом (свежезамороженной сыворотки крови мыши, что помогает избежать комплементарного лизиса эритроцитов). Можно использовать эритроциты человека и антисыворотку кролика, а в качестве источника комплемента взять человеческую сыворотку (АВ-сыворотку).

В силиконизированную пробирку вносят 0,1 мл лимфоцитов (2х10 ⁶) + 0,1мл 0,5 ЕАС комплекса. Смесь центрифугируют при 200 g/мин – 5 минут. Образовавшиеся розетки фиксируют, добавляя в пробирки 0,05 мл 3% раствора глутарового альдегида в фосфатном буфере. Фиксируют 20 минут при комнатной температуре и затем прекращают её добавлением убирают (сливают из пробирки), осадок пипетируют, из него готовят мазок на обезжиренном стекле, высушивают, фиксируют в метаноле. окрашивают.

Комплементарные розетки с участием зимозана.

Суспензию зимозана (содержание частиц зимозана 2-4 х10⁸) в растворе Хенкса смешивают с сывороткой крови мыши в соотношении 1:5, инкубируют при 37 С – 3 минут.

0,1 мл лимфоцитов + 0,1 мл зимозанкомплементарного комплекса инкубируют при 37 С 5 минут, центрифугируют при 200 g/мин готовят мазок на предметном стекле, высушивают, фиксируют метиленовым спиртом, окрашивают по Романовскому – Гимзе или метиленовой синькой. Микроскопия и подсчёт розеток.

50 Лабораторные методы оценки т – звена иммунитета. Показатели, Нормы.

В настоящее время для идентификации поверхностных структур лимфоцитов и ряда других клеток используют в основном 3 группы методов:

1 розеткообразование

2методы иммунофлюорисценции

3 иммуноферментные.

1 Наиболее дешёвым и довольно точным методом определения численности популяции Т-л является метод розеткообразования. Метод основан на наличии сродства между рецептором СD2 и гликопротеинами мембраны эритроцита барана. При смешивании лимфоцитов с эритроцитами барана образуются фигуры, получившие название розеток.

Количество таких розеткообразующих клеток (Е-РОК) соответствует количеству Т-лимфоцитов, для которых характерна экспрессия на поверхности СВ2 антигена.

Исследование Т звена иммунитета.

Определение количества Е-РОК

1 Приготовить 0,5% взвесь эритроцитов барана (предварительно их отмывают 3 раза физ раствором)

2 Определить исходное кол-во лимфоцитов в осадке (после выделения лимфоцитов)- должно быть 2х10⁶ мл (определение проводят в камере Горяева)

3 фиксация и изготовление препаратов. Для фиксации в пробирки добавить 0,05 мл раствора глютирового альдегида в фосфатном буфере на 10 – 15 минут в холодильнике (1-4 С). Для прекращения фиксации добавить избыток дистиллированной воды и процентрифуговать. Осадок пропипетировать и сделать из него мазки на стекле. Высушить препарат при комнатной температуре. Фиксировать в метаноле или смеси Никифорова. Окрасить по Романовскому – Гимзе.

4 Учёт результатов После окраски мазки промыть, высушить, микроскопировать в иммерсионнй системе микроскопа. Подсчитать процент лимфоцитов, фиксирующих на своей поверхности 3 и более эритроцитов. Производится подсчёт 200 клеток.