Э/ф в неденатурирующих условиях.

Подвижность оц- и дц- нуклеиновых кислот, зависимость от конформации (кольцо, супервитки), присутствия EtBr

Активно использовался перед Максамом-Гилбертом. Надо было разделить цепи перед введением метки.

Наносится на неденатуририрующий гель, но в момент нанесения полностью денатрурируется.

В большом объеме формамида растворяется дцДНК, нагревается до 95º, быстро охлаждается во льду и наносится на гель. Как только цепи в гель войдут, там будут конкурировать 2 процесса: ренатурация и локальные структуры, например, шпильки. Если нам повезет, и такие структуры будут разными, то и подвижность будет неодинакова. Если грубо, то если образовалась шпилька, то эффективная длина уменьшилась на длину этой шпильки.

Необходимо поддерживать низкую концентрацию при нанесении – очень толстый гель, очень длинный – 60 см, что очень неудобно.

Т = 4ºС. Чтобы отсрочить формирование дуплекса.

Подвижность дуплекса намного выше. Чуть ли не в 2 раза. Эффективная длина у него чуть-чуть побольше, а заряд в2 раза больше.

Электрофорез в денатурирующих условиях

Используется широко, причем и сейчас, только в другом формате, в капилляре.

Использовали для продуктов Сэнегера и Максама Гилберта. ³⁵S, ³²P, борьба за высокую разрешающую способность авторадиографии.

8М мочевина, формамид

Если хочется агарозы, анпример для крупной РНК, то не можем использовать и то, ни другое. Т.к. оба денатрурируют агарозу (нифига, кстати). Можем использовать щелочь.

Э/Ф в градиенте денатурирующего агента

Т акже м.б. в градиенте Т, т.к. это тоже денатурирующий агент

Еще называется гетеродуплексный анализ. Также для выявления SNP. Как метод скрининга этих замен – есть-нет.

С локуса получаем ампликон. Если есть полиморфизм у гетерозигот, после ПЦр будут нормальныедуплексы. Денатурируем и позволим снова ренатурировать, и наряду с нормальными дуплексами будет гетеродуплекс, т.к. чаще всего термодинамика мало отличается.

В геле существует градиент денатуранта, например, мочевины, концентраия ее по мере продвижения увеличивается. В начале небольшая, и ее недостаточно для денатрурации. Понятно, что подвижность дуплексов почти не отличается, и зарегистрировать напрямую не получится. Как только дуплексы достигают такого участка, что мочевины хватает для денатурации, они начинают двигаться в виде отдельных цепей. Дуплекс идеальныйрасплавится несколько позже, значит, у нас будет момент, когда гетеродуплекс уже расплавился, а гомо еще нет. А у дуплексов подвижность почти в 2 раза выше.

И этого сдвига достаточно для регистрации

Формировать гель с градиентом мочевины не очень удобно. Чаще используется термоградиент. А денатурирующего градиента добавляют немного.

Вариант на ту же тему – ионообменная хроматография.

Этим методом определяли происхождение Евы. (митохондриальная ДНК). А в Х-хромосоме искали хроматографией.

Афинный электрофорез

на примере электрофореза tRNA, имеющих сульфосодержащие основания

Гель содержит [(N-акрилоамино)фенил]ртуть:

Товарищам нужно было отделять модифицированные тРНК, содержащее серу, от немодифицированных. Молекулярная масса практически одинакова, заряд одинаковый.

Ввели в состав для гуппу, которая взаимодействует с атомами серы, и резко замедлять подвижность, в разы.

В состав геля можно включить практически любой лиганд.

Электрофорез на целлюлозе с неподвижными границами (изотахофорез в равновесии с эндоэлектроосмосом) (Абелев Г.И. и др.)

Т оварищи конструировали на заказ систему для фракционирования любых АГ, полипептидов. С прицелом на использование в медицинской практике.

• Должна быть равновесной: включил, ушел, пришел – ничего не выкипело и не сгорело. И все правильно и не искажено.

• Должна работать с биологическим материалом: слюна и т.д. Вносимые пробы могут иметь различный объем и состав, и это не должно было влиять на результат

Согласно второму условию, это д.б. изотахофорез. Но это неравновесный метод! Уйдет все в анодную камеру

Вспомнили про эндоэлектроосмос.

Взяли подложку, к которой пришиты ионогенный группы (пористая, бумага, например). И создали его в направлении, противоположном разделению компонентов в электрическом поле. Более того, в присутствии замыкающего электролита, осмос больше, чем в присутствии замыкающего.

Т.е. в начале осмос не большой, и общий вектор в направлении разделения. Но по мере движения границ осмос нарастает.

Осмотический поток зависит от количества молекул воды, которые движутся вместе с катионами. А в обратном направлении – вместе с катионами. Если с лидирующим анионом движется больше молекул воды, чем с замыкающим, то так и будет.

При правильном расчете осмотического потока, который можно регулировать с помощью ионогенных групп, пришитых к бумажке.

Один недостаток. Все компоненты непосредственно контактируют друг с другом – в виде зон.

Как бороться? Для антител – можно прогнать через бумажку с иммобилизованными антителами, и они свяжутся. Можно проявить таким способом.

Допустим, мы некоторые зоны нам надо разнести, а проявлять мы будем каим-то другим способом.

Можно добавить в разделяеую смесь спйсеры, электролиты в извесной концентрации, которые не будут взаимодействовать с компонентами, и у которых подвижность промежуточная. Шириной зоны мы можем управлять.Можем разнести компоненты на нужное расстояние.

Преимущества:

1. концентрирование проб, независимость результата от объема нанесения

2. независимость результата от времени ведения процесса

3. возможность легкой адаптации к самым разным задачам (разделяемым смесям)

CИСТЕМА КАПИЛЛЯРНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА «КАПЕЛЬ»

Капиллярный э/ф использовали давно. Проблема – нет синхронизации, а одного капилляра для детекции не хватало.

Но прогресс на месте не стоит. «Капель». На западе тоже производится. Экологи любят – для детекции загрязнения тризолом, фенолом.

• кварцевые с внешним полиимидным защитным покрытием капилляры (внутр. диаметр 50-75 мкм, внешний 365 мкм, общая длина 30-100 см);

• положительные и отрицательные напряжения до 30 кВ;

• для ввода пробы применяют избыточное давление (гидродинамический способ) или высокое напряжение (электрокинетический). Объем пробы составляет несколько нанолитров;

• для регистрации электрофореграмм используют УФ-детектирование непосредственно в капилляре, в прямом и косвенном вариантах

Д войной электрический слой. Стекло капилляра, при определенных рН протонируется и приобретает заряд «-», соответственно 1-й слой катионов, который прилежит к этой поверхности, практически не может двигаться под действие ЭП, т.к. электростатическое взаимодействие со стеклом сильнее.

Двойным слоем моно управлять, используя рН.

А поле здесь очень высокое – вплоть до кВ на см. Позволяет процесс проводить очень быстро. В геле такое делать нельзя! Возникает аномальная зависимость подвижности от размера. А в свободной среде – можно.

В середине капилляра – детектор, чтобы можно было использовать оба направления.

Нанесение образцов – гидростатически или электрокинетически, или комбинированно.

Гидростатичски – небольшой объем поместить засчет всасывания-засасывания жидкости. Есть возможность управлять макроскопическим потоком, и определенный столбик образца мы получим.

Электрокинетически – конец капилляра помещаем в пробирку. Туда же помещается второй электрод, катод, если нас анионы интересуют, под дейтвием ЭП в-ва попадают в капилляр, ведем недолго, чтобы зона была узкая, а потом собственно начинам э/ф.

Насколько прибор универсален?

Позволяет анализировать даже неионогенные в-ва, которые строго говоря в электрическом поле двигаться не должны.

Si=0 -> Si(OH)_{2 Ka1} ~ 4 x 10³

При C однозарядного электролита 1 – 0.1 mМ толщина двойного электрического слоя составляет в среднем 30 – 50 мкм. При диаметре канала 50 – 100 мкм практически вся жидкость, заполняющая капилляр, представляет собой диффузную часть двойного электрического слоя.

Электроосмотический поток направлен к катоду.

Используют Мицеллярную электрокинетическую хроматографию (МЭКХ):

использование встречного потока мицелл детергента (ДСН) для разделения нейтральных молекул форм веществ (аналог ВЭЖХ) .

изображает из себя хроматограф – гетрофазная система.

Раствор с достаточно высоким содержание детергента, образуются мицеллы (1 уровня). Если еще больше – образуются мицеллы 2 порядка. И эти макроскопические шарики – наша вторая фаза, причем гидрофобная. Мицеллы несут большой отрицательный заряд. В ЭП будут двигаться с контролируемой скоростью и синхронно, т.к. размер задается концентрацией. А потом поместим толуол и будем радостно за ним наблюдать (надо только как-то детектировать, но это задача решаемая).

Э/ф в псевдогеле. НК

"ГЕННЫЙ АНАЛИЗАТОР" ABI 310 (Applera = Applied Biosystems+Сelera Genomics)

Принцип тот же, трение о матрикс. Только гель не совсем честный, иначе мы его ни за что из капилляра не вытряхнем, а одноразовые капилляры – дорого.

Используется псевдогель, модифицированный линейный ПАА. Есть боковые группы, которые создают виртуальный гель засчет нековалентных взаимодействий. Начинает приближаться к агарозе. Этакий жидкий кристалл. Но никто не проверял. Хотя хорошо отфильтрованный линейный ПАА, в узком диапазоне длин, тоже работает.

Позволяет разделять продукты реакции Сенгера. Или просто разделять фрагменты – ГенСкан.

При разделении некоторые фрагменты имеют разную массу, но одинаковую подвижность – просто у флюорохромов разные заряды. Даже сдвигают подвижность до 1 звена.

Современные приборы – до 16 капилляры.