1.4 Титрование вирусов гриппа методом бляшек

При работе данным методом последовательные 10-кратные разведения вируса готовят на PBS, содержащем 0,5% желатина. Культуру для титрования можно выращивать в любом культуральном сосуде подходящего объема, но удобнее всего использовать шестилуночные планшеты. Это позволяет провести все титрование в одном термостате и избежать ошибок из-за неправильной нумерации чашек. В тех случаях, когда необходимо строго контролировать температуру, например в опытах с температурно-чувствительными мутантами при неразрешающей температуре, планшеты можно соединить в стопку, запечатать в пластиковом мешке и поместить в термостатированную водяную баню. При этом резко снижается вероятность искажения результатов из-за падения температуры при открывании дверцы термостата.

Заражение монослойных культур

Существенно, чтобы перед началом титрования монослой клеток был плотным.

1. С культуры сливают среду и промывают монослой теплым PBS для удаления остатков сыворотки. Чтобы полностью покрыть монослой в чашке диаметром 4—5 см, вирус вносят в объеме 0,2 мл.

2. Вирус, начиная с максимального разведения, наносят в центр чашки по каплям и распределяют по поверхности монослоя. Если вирус наносят на периферию чашки, силы поверхностного натяжения не дают ему распределиться по поверхности, и образующиеся бляшки скапливаются на периферии.

3. Адсорбцию вируса проводят 30 мин при комнатной температуре. Полезно один или два раза во время адсорбции покачать чашки, чтобы обеспечить равномерное распределение вируса по монослою.

Нанесение покрытия

По окончании адсорбции вирус удаляют и наносят на монослой 2 мл покрытия, состоящего из культуральной среды с 0,7—1,25% агара. Необходимо следить, чтобы температура покрытия при заливке не была слишком высокой, в противном случае клетки погибнут. Однако не менее важно, чтобы агар не был и слишком холодным и не застыл в пипетке. Для клеток ФЭК оптимальная температура покрытия составляет 45 °С. Для приготовления покрытия смешивают равные объемы двукратного концентрата среды, нагретого до 45 °С, и двукратного концентрата агара, охлажденного до 60 °С. Готовое покрытие охлаждают до 45 °С.

Для быстрого плавления агара очень удобно использовать микроволновую печь. Важно избегать образования пузырей, поскольку они могут исказить конечные результаты, имитируя бляшки или, наоборот, маскируя их. Если титрование проводят на клетках, менее устойчивых к высокой температуре, чем ФЭК, вместо агара рекомендуется использовать агарозу с низкой температурой гелеобразования, застывающую при температуре ниже 37 °С. Можно использовать в качестве покрытия и среду с карбоксиметилцеллюлозой. При этом нет необходимости строго выдерживать температурный интервал, как при работе с агаром, однако использование КМЦ может приводить к искажению формы бляшек, если во время титрования чашки сдвигаются или наклоняются.

Окрашивание бляшек

Обычно через 2—3 дня после заражения бляшки достигают такого размера, что их можно обнаружить при окрашивании. Если инкубацию клеток проводят под агаровым покрытием, для окрашивания можно использовать нейтральный красный.

1. Содержащую агар среду для покрытия готовят, как описано выше, и добавляют нейтральный красный до конечной концентрации 0,1%.

2. На каждую чашку диаметром 4 см наносят 2 мл этой среды, как описано выше.

3. Чашки вновь помещают в термостат на 3—4 ч; за это время бляшки становятся видимыми.

Если нет возможности подсчитать бляшки сразу же после окрашивания, следует иметь в виду, что они остаются видимыми по крайней мере в течение 48 ч, причем их размер не увеличивается при помещении в герметически закрытый контейнер в атмосфере 5%-ного СОг при 4°С. Если необходимо получить более стабильный препарат, применяют альтернативный метод окрашивания. В этом случае агаровое покрытие удаляют и фиксируют клеточный монослой буфером с формальдегидом.