15 Транскриптомные и протеомные подходы

Транскриптомной анализ позволяет определить изменения в синтезе РНК в маштабе всего генома или его части

Транскриптомные- совокупность всех транскриптов ( продуктов активности фермента РНК-полимераза), синтезируемых одной ниткой или группой клеток, вклучая РНК и некодирующие РНК. В отличие от генома , который, как правила,одинаков для всех клеток одной линии, транскриптон может сильно меняться в зависемости от условий окружающей среды, отражает профиль экспрессии генов в данный момент времени.

Использование биотипов

Протеомный анализ направлен на однавременное изучение многих индивидуальных белков, совокупность которых составляет определенную систему. Придметом изучения протеаники являются синтез, модификации и замена белков иследуемого объекта позволяет индефецировать белки по молекулярной смеси их протеолитических ферментов использовании методов, позволяющих определить количество того или иного белка в образце, индифицировать белок его первичную структуру и пост-трансмеционные модификации.

16. Эволюция геномов

1. Эволюция прокариотического и эукариотического геномов

1.1 Геном предполагаемого общего предка про- и эукариот

Общие принципы организации наследственного материала, представленного нуклеиновыми кислотами, а также принципы записи генетической информации у про- и эукариот свидетельствуют в пользу единства их происхождения от общего предка, у которого уже была решена проблема самовоспроизведения и записи информации на основе репликации ДНК и универсальности генетического кода. Однако геном такого предка сохранял большие эволюционные возможности, связанные с развитием надмолекулярной организации наследственного материала, разных путей реализации наследственной информации и регуляции этих процессов.

Многочисленные указания на различия в организации генома, деталях процессов экспрессии генов и механизмов ее регуляции у про- и эукариот свидетельствуют в пользу эволюции названных типов клеток по разным направлениям после их дивергенции от общего предка.

Существует предположение, что в процессе возникновения жизни на Земле первым шагом явилось образование самовоспроизводящихся молекул нуклеиновых кислот, не несущих первоначально функции кодирования аминокислот в белках. Благодаря способности к самовоспроизведению эти молекулы сохранялись во времени. Таким образом, первоначальный отбор шел на способность к самосохранению через самовоспроизведение. В соответствии с рассмотренным предположением позднее некоторые участки ДНК приобрели функцию кодирования, т.е. стали структурными генами, совокупность которых на определенном этапе эволюции составила первичный генотип. Экспрессия возникших кодирующих последовательностей ДНК привела к формированию первичного фенотипа, который оценивался естественным отбором на способность выживать в конкретной среде.

Важным моментом в рассматриваемой гипотезе является предположение о том, что существенным компонентом первых клеточных геномов была избыточная ДНК, способная реплицироваться, но не несущая функциональной нагрузки в отношении формирования фенотипа. Предполагают, что разные направления эволюции геномов про- и эукариот связаны с различной судьбой этой избыточной ДНК предкового генома, который должен был характеризоваться достаточно большим объемом. Вероятно, на ранних стадиях эволюции простейших клеточных форм у них еще не были в совершенстве отработаны главные механизмы потока информации (репликация, транскрипция, трансляция). Избыточность ДНК в этих условиях создавала возможность расширения объема кодирующих нуклеотидных последовательностей за счет некодирующих, обеспечивая возникновение многих вариантов решения проблемы формирования жизнеспособного фенотипа. [1]

1.2 Эволюция прокариотического генома

По мере совершенствования и повышения надежности главных механизмов потока информации значение избыточной ДНК в повышении выживаемости организмов снижалась. В такой ситуаций одним из возможных направлений изменения генома было уменьшение его размеров за счет утраты некодирующих нуклеотидных последовательностей. Именно так можно представить эволюционный путь, пройденный геномом современных прокариот. Одновременно в качестве механизмов, поддерживающих выживаемость этих форм, в историческом развитии закреплялось свойственное им короткое время генерации, т.е. интенсивное размножение и быстрая смена поколений (кишечная палочка делится каждые 20 мин). Перечисленные особенности хорошо сочетаются с гаплоидностью прокариот, что приводит к воспроизведению в фенотипе любой мутации.

Экспрессия 95% ДНК, относительно малые размеры генома, гаплоидность, проявление в фенотипе практически каждой мутации в сочетании с коротким временем генерации обусловливают высокую приспособленность. Вместе с тем для прокариотического типа организации не свойственны обширные и разнообразные изменения структуры. Вследствие этого описанное направление эволюции, обеспечивая высокую способность к выживанию (прокариоты существуют на Земле около 3,5 млрд. лет), является тупиковым в плане прогрессивной эволюции живых существ. [1]

1.3 Эволюция эукариотического генома

В отличие от изменений прокариотического генома преобразования генома в эволюции эукариот связаны с нарастающим увеличением количества ДНК. Это увеличение наблюдается в процессе прогрессивной эволюции эукариот . На фоне такого увеличения большая часть ДНК является «молчащей», т.е. не кодирует аминокислот в белках или последовательностей нуклеотидов в рРНК и тРНК. Даже в пределах одного гена молчащие (интроны) и кодирующие (экзоны) участки могут перемежаться. В составе ДНК обнаруживаются высоко и умеренно повторяющиеся последовательности. Вся масса ДНК распределена между определенным числом специализированных структур — хромосом. Хромосомы в отличие от нуклеоида прокариот имеют сложную химическую организацию. Эукариоты в большинстве случаев диплоидны. Время генерации у них значительно больше, чем у прокариот. Отмечаемые особенности, оформившиеся в ходе эволюции генома эукариот, допускают широкие структурные изменения и обеспечивают не только адаптивную (приспособительную), но и прогрессивную эволюцию.

Среди перечисленных выше моментов увеличение размеров генома в эволюции эукариот привлекает особое внимание. Этот процесс может осуществляться различными способами. Наиболее резко размер генома изменяется в результате полиплоидизации, которая достаточно широко распространена в природе. Она заключается в увеличении количества ДНК и хромосом, кратном гаплоидному. Достигаемое в результате состояние полиплоидии приводит к увеличению дозы всех генов и создает избыток «сырого» генетического материала, который впоследствии видоизменяется в результате мутаций и отбора.

По-видимому, в ходе эволюции в результате накопления мутаций и дивергенции нуклеотидных последовательностей полиплоидизация сопровождалась переходом к диплоидному состоянию. Само по себе увеличение дозы генов еще не означает достижения однозначно положительного биологического результата. Об этом свидетельствует развитие в эволюции эукариот механизмов компенсации возрастающей дозы генов в ходе их экспрессии путем сокращения времени жизни в клетках зрелой РНК. Так, у тетраплоидных карповых рыб в ответ на увеличение дозы генов рРНК в молекулах рРНК соматических клеток возникают скрытые внутренние разрывы, которые приводят к преждевременному их старению и сокращению содержания в цитоплазме.

Если бы увеличение объема генома происходило только в результате полиплоидизации, то в природе должно было бы наблюдаться скачкообразное изменение его размеров. На самом деле этот процесс демонстрирует плавное увеличение содержания ДНК в геноме. Это позволяет допустить возможность других механизмов, изменяющих его объем.

Действительно, некоторое значение в определении размера генома имеют хромосомные перестройки, сопровождающиеся изменением содержания ДНК в них, такие, как дупликации, делеции и транслокации. Они обусловливают повторение, утрату некоторых последовательностей в составе хромосомы или перенос их в другие хромосомы.

Важным механизмом увеличения объема генома является амплификация нуклеотидных последовательностей, которая заключается в образовании их копий, что приводит к возникновению повторяющихся участков ДНК. Особенностью генома эукариот является наличие таких повторов в большом количестве, свидетельствующее о существенном вкладе механизма амплификации в увеличение размеров наследственного материала. Амплифицированные последовательности образуют семейства, в которых они собраны вместе (тандемная организация) или же распределяются по разным хромосомам. Конкретные изменения, приводящие к амплификации, бывают различными. Появление тандемов повторяющихся последовательностей объясняется, например, неравным кроссинговером, вследствие которого возникают многократные дупликации отдельных участков ДНК. Возможна амплификация путем вырезания фрагмента с последующей его репликацией вне хромосомы и встраиванием копий в другие хромосомы. Предполагают также амплификацию, осуществляемую путем «обратной транскрипции» ДНК на РНК с участием фермента обратной транскриптазы с последующим встраиванием копий ДНК в различные локусы хромосом.

Во всех случаях амплификация некоторой последовательности приводит к возникновению в геноме более или менее многочисленных повторов и способствует некратному увеличению его объема. Наличие таких повторов в сочетании с мутационным процессом является предпосылкой дивергентной эволюции однотипных последовательностей в пределах семейства с соответствующим изменением свойств кодируемых белков или РНК.

Ярким примером эволюционной судьбы амплифицированных нуклеотидных последовательностей являются семейства глобиновых генов, широко распространенных в природе у видов разных уровней организации. У высших позвоночных известен ряд глобиновых генов, контролирующих синтез полипептидов гемоглобина. У человека в геноме имеется восемь активных глобиновых генов, образующих два семейства.

Семейство генов, определяющих синтез а-глобинов, содержит два–глобиновых гена, активно функционирующих в эмбриогенезе, и два -глобиновых гена, которые экспрессируются у плода и взрослого человека. Это семейство генов располагается в 16-й хромосоме в следующем порядке: 5' — 2 —1— 2—1—3'. Семейство генов, определяющих синтез глобинов, расположенное в 11-й хромосоме, содержит –глобиновый ген эмбриона, два сходных –глобиновых гена плода и , малый - и большой -глобиновые гены взрослых: 5' — — — — — — 3'.

Изучение гомологии продуктов указанных генов и генов миоглобина у разных видов организмов позволило предположить общность происхождения этих семейств. Вероятно, около 1100 млн. лет назад произошла дупликация гена-предшественника, давшая начало гемоглобиновым и миоглобиновым генам. Позднее, около 500 млн. лет назад, на ранней стадии эволюции позвоночных произошла дупликация, давшая начало двум ( и ) семействам глобиновых генов, сопровождавшаяся транслокацией. Примерно 200 млн. лет назад очередная дупликация привела к возникновению в семействе –глобиновых генов генов –глобинов плодов и взрослых. Около 100 млн. лет назад произошло образование – -глобиновых генов и, наконец, 40 млн. лет назад появились – и –глобиновые гены.

Семейства – и –глобиновых генов организованы в генные кластеры, возникшие, вероятно, в результате тандемной дупликации генов. В составе указанных кластеров наряду с активно функционирующими на разных стадиях онтогенеза генами обнаружены неактивные, или псевдогены. Последние возникли, вероятно, в результате появления в них изменений, несовместимых с возможностью их экспрессии. В семействе –глобиновых генов содержится два псевдогена: и . В -семействе имеется один псевдоген. Дивергенция амплифицированных последовательностей с образованием разных генов или их семейств обусловлена накоплением в них различных изменений в виде замен оснований или других генных мутаций. О гомологии глобиновых генов обоих семейств свидетельствует наличие во всех активных глобиновых генах позвоночных двух интронных участков, занимающих в них строго одинаковое положение. Такую же организацию имеют и псевдогены у человека, у кролика. Однако в псевдогене мыши в ходе эволюции оба интрона оказались точно вырезанными.

Результатом амплификации небольших последовательностей ДНК в пределах функциональной единицы является удлинение гена, при котором из простых генов могут возникать более сложные. Это может происходить за счет тандемных дупликаций. Например, в генах, кодирующих вариабельные участки иммуноглобулинов мыши, последовательности из 600 п.н. образуются в результате 12 тандемных повторов исходной предковой последовательности в 48 п.н. Другим примером удлинения гена посредством тандемных дупликаций служит ген коллагена, который у курицы состоит из 34 000 т.н. и содержит больше 50 экзонов. Длина таких участков во всех случаях кратна девяти нуклеотидным парам. Эволюция этих экзонов, очевидно, шла от гипотетического исходного строительного блока длиной в 54 пары нуклеотидов.

Таким образом, амплификация нуклеотидных последовательностей, происходившая в процессе эволюции генома, обеспечивала не только его количественное увеличение, появление семейств генов, но и создавала предпосылки для накопления в них изменений, дивергенции генов, увеличения разнообразия контролируемых ими продуктов.

Ортологи и парологи

Сравнительный анализ последовательностей нуклеотидов в ДНК и аминокислот в белках потребовал развития традиционного понятия гомологии. При анализе последовательностей принято различать ортологию и паралогию (и, соответственно, ортологи и паралоги). Гомологичные последовательности называют ортологичными, если к их разделению привел акт видообразования: если ген существует у некоего вида, который дивергирует с образованием двух видов, то копии этого гена у дочерних видов называются ортологами. Гомологичные последовательности называют паралогичными, если к их разделению привело удвоение гена: если в пределах одного организма в результате хромосомной мутации произошло удвоение гена, то его копии называют паралогами. Ортологи обычно выполняют идентичные или сходные функции. Это не всегда справедливо в отношении паралогов. В виду отсутствия давления отбора на одну из копий гена, подвергшегося удвоению, эта копия получает возможность беспрепятственно мутировать далее, что может привести к возникновению новых функций. Гены, кодирующие миоглобин и гемоглобин, обычно считаются древними паралогами. Сходным образом, четыре известных класса гемоглобинов (гемоглобины A, A2, S и F) — паралоги друг друга. В то время как каждый из этих генов служит той же самой основной функции транспорта кислорода, их функции уже слегка дивергировали: гемоглобин зародыша (фетальный гемоглобин F) имеет большее сродство к кислороду, чем гемоглобин взрослого человека. Другой пример: гены инсулина у крыс и мышей. У грызунов имеется пара паралогичных генов, однако вопрос о том, произошла ли дивергенция функций, остается открытым. Паралогичные гены часто принадлежат одному и тому же виду, однако это не необходимо. Например, гены гемоглобина человека и миоглобина шимпанзе — паралоги. Это общая проблема биоинформатики: когда геномы раних видов секвенированы и обнаружены гомологичные гены, невозможно сразу же сделать вывод о том, что эти гены выполняют ту же самую или сходную функцию, поскольку они могут оказаться паралогами, функции которых дивергировали.

№17 . Повторы в геномных последовательностях были обнаружены довольно давно.

Дупликации. Повторы в геномных последовательностях были обнаружены довольно давно. Повторы в геномах можно классифицировать по-разному:

(1) Некоторые геномы сами являются дупликациями.

(2) Сегментарные дупликации, особенно выраженные в геноме человека. Некоторые из этих дупликаций связаны с геномными болезнями.

Сегментарные дупликации занимают 3.3% генома человека

(3) Дупликации генов и генные семейства.

(4) Множественные копии мобильных элементов.

(5) Простые повторы (короткие, от 1 до нескольких десятков нуклеотидов, в том числе микросателлиты и минисателлиты , которые по-видимому, не кодируют никаких продуктов.

(6) Блоки тандемно повторенных последовательностей, такие как последовательности в центромерах, теломерах, коротких плечах акроцентрических хромосом, кластеры рибосомальных генов.

(7) Инактивированные ретротранспозированные копии генов.

(8) Внутрибелковые повторы .По частоте встречаемости различают низкокопийные (примерно до 10 копий), умеренно повторяющиеся последовательности (от 10 до 104), часто повторяющиеся последовательности (более 105). По типу следования различают диспергированные и тандемные повторы.

Геном человека известен на 94% .На основании этого материала можно сделать следующие выводы. Повторы занимают по крайней мере 50% генома. В геноме человека (и млекопитающих) встречаются мобильные элементы четырех типов.

Количество повторяющихся последовательностей в геноме человека составляет около 50 % всего генома, тогда как количество генов, кодирующих белки примерно на порядок меньше.

В то же время очевидно, что повторы несут какую-то важную функцию, не связанную с кодированием белков, так как они повсеместно встречаются и, по многочисленным данным, участвуют во многих процессах, обуславливающих экспрессию генов, рекомбинацию, мутагенез, клеточное старение…

Было предложено большое количество гипотез для объяснения наличия этого странного феномена, но ни одна из них до конца не объясняет всех обнаруженных фактов.

Наиболее распространёнными на сегодня являются гипотеза о паразитическом происхождении таких последовательностей, гипотезы об их участии в структурной организации хромосом, участии в механизмах клеточного старения, резерве ДНК, участии в мутагенезе и тому подобное.

Предлагается к обсуждению гипотеза о том, что повторяющиеся последовательности несут одну из важнейших функций в геноме – кодирование и передачу количественной информации.

То есть, повторяющиеся последовательности ДНК представляют собой числа, закодированные в единичной системе счисления.

№17 . Повторы в геномных последовательностях были обнаружены довольно давно.

Дупликации. Повторы в геномных последовательностях были обнаружены довольно давно. Повторы в геномах можно классифицировать по-разному:

(1) Некоторые геномы сами являются дупликациями.

(2) Сегментарные дупликации, особенно выраженные в геноме человека. Некоторые из этих дупликаций связаны с геномными болезнями.

Сегментарные дупликации занимают 3.3% генома человека

(3) Дупликации генов и генные семейства.

(4) Множественные копии мобильных элементов.

(5) Простые повторы (короткие, от 1 до нескольких десятков нуклеотидов, в том числе микросателлиты и минисателлиты , которые по-видимому, не кодируют никаких продуктов.

(6) Блоки тандемно повторенных последовательностей, такие как последовательности в центромерах, теломерах, коротких плечах акроцентрических хромосом, кластеры рибосомальных генов.

(7) Инактивированные ретротранспозированные копии генов.

(8) Внутрибелковые повторы .По частоте встречаемости различают низкокопийные (примерно до 10 копий), умеренно повторяющиеся последовательности (от 10 до 104), часто повторяющиеся последовательности (более 105). По типу следования различают диспергированные и тандемные повторы.

Геном человека известен на 94% .На основании этого материала можно сделать следующие выводы. Повторы занимают по крайней мере 50% генома. В геноме человека (и млекопитающих) встречаются мобильные элементы четырех типов.

Количество повторяющихся последовательностей в геноме человека составляет около 50 % всего генома, тогда как количество генов, кодирующих белки примерно на порядок меньше.

В то же время очевидно, что повторы несут какую-то важную функцию, не связанную с кодированием белков, так как они повсеместно встречаются и, по многочисленным данным, участвуют во многих процессах, обуславливающих экспрессию генов, рекомбинацию, мутагенез, клеточное старение…

Было предложено большое количество гипотез для объяснения наличия этого странного феномена, но ни одна из них до конца не объясняет всех обнаруженных фактов.

Наиболее распространёнными на сегодня являются гипотеза о паразитическом происхождении таких последовательностей, гипотезы об их участии в структурной организации хромосом, участии в механизмах клеточного старения, резерве ДНК, участии в мутагенезе и тому подобное.

Предлагается к обсуждению гипотеза о том, что повторяющиеся последовательности несут одну из важнейших функций в геноме – кодирование и передачу количественной информации.

То есть, повторяющиеся последовательности ДНК представляют собой числа, закодированные в единичной системе счисления.

№ 18 Мобильные элементы эукариот

Стандартно, есть средняя часть, которая кодирует ген, содержащий необходимый для перемещения фермент - транспозазу. Центральная часть обычно ограничена набором повторов , чаще всего относительно длинные инвертированные повторы с прямыми поворотами по концам

Любой домен, который обеспечивает перемещение мгэ, разрезает ДНК в точке инсерции транспозона –ступенчато, размер ступеньки –разнообразный. У нас получаются липкие концы, затем к ним присоединяется транспозон , а бреши застраиваются стандартной системой репарации. Мы получаем дуплицированные последовательности липких концов.

Транспозон –молекула ДНК, которая стремится максимально размножиться, но есть ограничения со стороны бактериальной клетки на увеличение генома ( не хватает Э)

Бактериальные транспозоноы можно классифицировать по нескольким критериям :

• собственно транспозоны ( в состав входят дополнительные гены)

• IS –элементы ( в состав не входит ничего, кроме min набора генов, необходимого для транспозиции)

2 способ классификации :

 Простые транспозоны

 Составные ( составлены из простых мгэ , как правило это IS –элементы) –это искусственное образование может формироваться в любой момент

Транспозиция бывает

А) прямая ( перемещается сам транспозон)

Б) инвертированная ( перемещается часть плизмиды, которая ограничена IS –элементом)

в геном каждой бактерии входит около десятка IS –элементов. Они различаются по своему размеру, размеру инвертированных поворотов, размеру дупликации в точке инсерции ( обычно 9 пар)

Мобильные генетические элементы (МГЭ, подвижные элементы, транспозируемые элементы, транспозоны и т.д.)

№19 мобильные элементы прокариот

Интересно, что для ДНК эукариот характерно присутствие нескольких версий ДНК –транспозонов. В состав кажого транспозона входит несколько семейств:

• Автономный -полноразменрый транспозон, который может перемещаться самостоятельно

• Неавтономный – не может перемещаться самостоятельно, но т. к это делеционный вариант того же самого транспозона , то транспозаза распознает их концы –инвертированные повороты, и обеспечивает их перемещение

Ретротранспозоны – важнейший класс МГЭ , размножаются в такой степени, что занимают значительную часть генома

Механизм перемещения ретротранспозонов

o Классический ретровирус ,при заражении кл-ки его ДНК , попадает в клетку, далее идет синтез кДНК копии, она становится 2цепочечной, и такая ДНК ретровируса встраивается в геномную ДНК клетки, затем идет транскрипция этой ДНК, синтез белков, упаковка вирусных частиц и цикл инфекции повторяется

Ретротранспозоны представлены РЕТРОВИРУСОМ и НЕРЕТРОВИРУСОМ

РЕТРОВИРУСЫ – имеют длинные концевые повторы, фермент , который участвует в перемещении – интеграза

НЕРЕТРОВИРУСЫ –нет повторов , фермент –нуклеаза

№ 20 Горизонтальный перенос генов

Геномы прокариот подвержены быстрым изменениям в результате горизонтального переноса ДНК

Размер и структура генома близкородственных видов и даже штаммов одного вида бактверий могут существенно различаться в результате чрезвычайно активных процессов горизонтального переноса

Механизмы горизонтального переноса

o Трансдукуия вирусами бактерий ( бактериофагами)

o Коньюгация – перенос плазмид из одной клетки в другую

o Трансформация – поглощение бактериальными клетками « свободной» ДНК

Динамичность генома энтеробактерий обусловлена большим набором « необязательных» компонентов, способных свободно перемещаться между геномами, занимающих одну нишу видов

Представители семейст Entereobacteriaceae имеют геномы размером около 5 млн. н.п , содержащие около 5 тыс генов

Значительная часть генома входит в состав хромосомных островов патогенности или расположена в ДНК фагов или плазмид, набор которых сильно отличается даже у разных штаммов одного вида

Острова патогенности -интегрированная бактериофагом плазмида или фрагмент ДНК , ограниченный с 2 сторон транспозонами из встроенных геномов

Легкость горизонтального переноса и сильное эволюционное давление на минимализацию генома приводят к тому, что геном отдельной бактерии может не модержать весь набор генов , необходимый для нормального существования вида бактерий

Пангеном – совокупность всех генов одного вида бактерий, которые могут быть скомбинированы в геном одной клетки за счет механизмов горизонтального переноса.