1. Ингибиторы апоптоза.
А) Физиологические ингибиторы: факторы роста; экстраклеточный матрикс; нейтральные аминокислоты; цинк; андрогены; эстрагены; -ИЛ 2,3,4,10; Интерферон а.
Б) Гены вирусов (онковирусы): аденовируса; бакуловируса; вируса коровьей оспы; вируса Эпштейна-Барр; вируса африканской свиной лихорадки; вируса герпеса.
В) Фармакологические агенты: ингибиторы кальпаина; ингибиторы цистеиновых протеаз; индукторы опухолей: форболовые эфиры, фенобарбитал, α-гексохлорциклогексан.
2. Индукторы апоптоза
А) Физиологические активаторы: семейство ТNF, Fаs; нейротрансмитеттеры: глутамин, дофамин; устранение ростовых факторов; потеря контакта с матриксом; кальций; глюкокортикоиды; -ИЛ 1, 10; Интерферон у.
Б) Агенты, вызывающие повреждение: воздействие температуры;
вирусная инфекция; бактериальные токсины; онкогены; опухолевые супрессоры: р53; цитотоксические Т-клетки; свободные радикалы; антиметаболиты.
В) Агенты, связанные с лечением каких-либо заболеваний:
химиопрепараты: цисплатин; доксорубицин, блеомицин; метотрексат, винкристин; гамма-излучение; УФ-излучение.
Г) Токсины.
Таким образом, условия ингибирования или индукции апоптоза весьма разнообразны и могут быть сведены к действию внешних факторов, воспринимаемому рецепторами и отсутствию защиты от реализации внутренней программы апоптоза.
ЭФФЕКТОРЫ АПОПТОЗА. Известны два относительно автономных проявления общего эффекторного пути апоптоза — 1. активация сериновых протеаз и 2. снижение трансмембранного потенциала митохондрии.
1. Активация сериновых протеаз - они образуют семейство из 12 ферментов, названных каспазами. Перечисленные выше индукторы апоптоза активируют каспазы, т. е. цистеиновые протеиназы, расщепляющие пептидную связь вслед за аспартатом. Из дюжины известных каспаз по крайней мере восемь имеют отношение к апоптозу. Номера каспаз не соответствуют их порядку в апоптозном каскаде, и принятое деление на «инициаторы» и «исполнители» довольно расплывчато. Каспазы предсуществуют в цитозоле в виде неактивных предшественников (прокаспаз), но, подвергаясь ограниченному протеолизу (предыдущая каспаза расщепляет последующую), обретают эффекторную (протеолитическую) активность. Этому способствует и формирование надмолекулярных комплексов (апоптосом), которые образуются при гетеродимеризации каспаз с апоптогенными внутриклеточными белками или при гибридизации самих каспаз.
Мишенями для каспаз служат многочисленные белки, в том числе ферменты и ингибиторы, задействованные в клеточном гомеостазе. В целом, участие каспаз в апоптозе образно сравнивают с хорошо продуманной и организованной военной операцией. Они отрезают гибнущую клетку, разрушая межклеточные контакты и ее внутреннюю инфраструктуру (цитоскелет).
2. Снижение мембранного потенциала митохондрий является следствием внезапного повышения проницаемости мембран митохондрий, которое приводит к выравниванию концентраций ионов по обе стороны мембран. Это проявляется в ослаблении положительного заряда внутренней поверхности мембран, а затем в выходе Са2+, снижении содержания в клетке восстановленного глутатиона, усиленному образованию супероксиданиона. Следствием повышения проницаемости мембран митохондрий является выход в цитоплазму факторов, способных вызвать деградацию хроматина в изолированных ядрах. Как только происходит полная утрата митохондриального потенциала, апоптоз становится неизбежным.
Итак, в реализации и контроле апоптоза участвуют многочисленные внутриклеточные факторы, он может быть вызван действием разнообразных внешних агентов. Из этого следует неизбежность существования патологии, связанной с нарушениями в звеньях индукции и регуляции апоптоза. Выделяют две группы патологических процессов, связанных с ослаблением и усилением апоптоза.
«СУДЬБА» АПОПТОЗНЫХ КЛЕТОК. Эволюционируя, апоптоз завершается вторичным некрозом, который проявляется повышением проницаемости плазматической мембраны для постмортальных красителей (трипановый синий, йодид пропидиума). В отличие от первичного некроза, когда повреждение мембраны служит пусковым фактором клеточной гибели, при апоптозе это знаменует окончание процесса. Впрочем, в естественных условиях дело обычно не доходит до вторичного некроза, так как апоптирующие клетки уничтожаются профессиональными (макрофаги) и непрофессиональными (например, фибробласты) фагоцитами. Макрофаги, поглотившие апоптозные клетки, обнаруживаются в очагах воспаления, а также в культурах ίn vίtro.
Механизм распознания апоптозных клеток детерминирован необычными поверхностными структурами, которые появляются на внешнем слое плазматической мембраны и побуждают соседние клетки к фагоцитозу. Их образно называют сигналами «съешь меня». Одним из кандидатов на роль такого рода сигнальных молекул служит ФС / фосфолипидный слой/. В норме остатки ФС локализованы во внутреннем слое клеточной мембраны, но при апоптозе, благодаря потере физиологической асимметрии мембранных фосфолипидов, они выныривают на поверхность и распознаются специфическими рецепторами макрофагов.
Реакцию усиливает ряд цитокинов, которые не действуют на ФС-зависимое поглощение апоптозных клеток. Поглощение заметно усиливается при адгезии макрофагов на внеклеточном матриксе, в частности на фибронектине. Моноциты не поглощают апоптозные клетки, но обретают такую способность после трансформации в макрофаги.
Недавно был описан новый механизм, позволяющий макрофагам осуществлять негативный отбор апоптозных клеток. Оказалось, что при встрече с макрофагами в живых клетках возникает отталкивающий сигнал, который прекращает это взаимодействие. Такую реакцию обеспечивает гомофильное взаимодействие на поверхности лейкоцитов и макрофагов. В апоптозных клетках передача сигнала нарушается, что ведет к более длительному контакту с макрофагами. Это облегчает узнавание вышеописанных маркеров на апоптозных клетках и их элиминацию.
Кроме сигналов «съешь меня» для привлечения фагоцитов апоптоз-ные клетки секретируют особый хемотаксический фактор — фосфолипидлизофосфатидилхолин /ФЛ/, для высвобождения которого требуется активность каспазы-3. Этот фактор стимулирует миграцию моноцитов и макрофагов в направлении его источника (апоптозных клеток), что обеспечивает своевременное и эффективное удаление погибающих клеток. Принципиально, что фагоцитоз апоптозных клеток не только не возбуждает секреции провоспалительных цитокинов, но даже подавляет ее благодаря аутокринного ингибирования. Неслучайно, своевременному удалению апоптозных клеток придается большое значение в предупреждении и обратном развитии воспалительных реакций.
АПОПТОЗ И ПАТОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ. Представления о запрограммированной смерти клеток, долгое время не привлекавшие внимания клиницистов, сегодня выдвинулись в число самых популярных и интригующих проблем медицины. Апоптоз ассоциируется с патогенезом злокачественных опухолей, атрофических (в частности, нейродегенеративных) и гиперпластических процессов, аутоиммунных заболеваний, вирусных инфекций. Каждая из приведенных ситуаций может быть проанализирована с позиций дисбаланса между нацеленностью клеток на выживание, пролиферацию и апоптоз. Направленная регуляция апоптоза явится, возможно, одним из базисных принципов терапевтической стратегии будущего, и уже сегодня лечебный эффект многих цитотоксических противоопухолевых препаратов связывают с их способностью усиливать апоптоз.
Перспективной выглядит идея регуляции экспрессии апоптозных и антиапоптозных генов при помощи антисмысловых олигонуклеотидов, блокирующих мРНК для определенных белков. Она уже получила подтверждение в опытах по торможению пролиферации лейкозных клеток при хронической миелоидной лейкемии.
Влияние на апоптоз (усиление или ослабление) оказывают различные микроорганизмы - вирусы, бактерии, грибы, простейшие. С этим связаны новые взгляды на патогенез инфекционной патологии. Примером могут служить представители семейства энтеробактерий: признаки апоптозной гибели обнаружены в культурах эпителиальных клеток и макрофагов, инфицированных шигеллами, сальмонеллами, эшерихиями, йерсиниями. Во многом это связано с межмолекулярными эффектами белков-токсинов, вводимых в клетку бактериями через аппарат секреции III типа. Они могут оказать влияние на клеточные гены в результате взаимодействия с протеинкиназами или иными факторами, контролирующими транскрипционный процесс. Не исключено, что данный механизм играет определенную роль в развитии энтеробактериальных инфекций.
Установлено, что многие вирусы, вмешиваясь в регуляцию внутриклеточного гомеостаза, меняют соотношение между ростовыми и апоптозными потенциями инфицированных клеток. Известно более десятка вирусных генов, которые кодируют факторы, усиливающие апоптоз. Обнаружены они и у вирусов человека (аденовирусы, гер-песвирусы, папилломавирусы, ортомиксовирусы, вирус иммунодефицита человека, вирус гепатита В и др.). В ряде случаев вирус индуцированный апоптоз коррелирует с усилением экспрессии гена р53, претендующего на одну из ключевых позиций в индукции апоптоза..
Опережающая смерть клетки, несущей зачаток вируса — исход, выгодный скорее хозяину, чем вирусу. Неслучайно об этом говорят как об альтруистическом самоубийстве, подразумевая, что клетка предпочитает погибнуть, исключив возможность размножения потенциально опасного вируса.
Логика подсказывает, что вирусы должны обладать и альтернативным механизмом, который, продлевая жизнь клеток, создавал бы условия для воссоздания как можно более многочисленного вирусного потомства в литическом цикле или обеспечивал переход вируса в латентное состояние (персистенцию). Действительно, некоторые вирусы синтезируют белковые продукты, которые блокируют апоптозный ответ инфицированных клеток. Это достигается разными способами, но их принцип сводится к двум механизмам — повышение экспрессии антиапоптозных (ростстимулирующих) генов клетки и инактивация эффекторных молекул апоптоза. К первой группе можно отнести стимуляцию протоонкогенов типа, это, в частности, наблюдается при персистенции вируса Эпстайна-Барр в В-лимфоцитах, ко второй -блокаду белка Р53, продукта апоптозстимулирующего гена р53 (например, Е6 — протеин вируса папилломы человека).
Известно, что вирусы вызывают и непрямой цитопатический эффект. В этом случае зараженные клетки атакуются эффекторами иммунитета, прежде всего СD8+ Т-лимфоцитами. В реализации цитотоксических потенций Т-лимфоцитов также участвует апоптоз, возбуждаемый в клетках-мишенях. В качестве вероятных механизмов рассматривается прямое действие эффекторных молекул, преформированных в Т-лимфоцитах, а также рецептор зависимая активация апоптозной программы атакуемых клеток. В первом случае действуют апоптозные протеазы (гранзимы), которые проникают в клетки-мишени через поры, образуемые в плазматической мембране перфоринами лимфоцитов. Во втором, процесс запускается через системы Fаs-системы и является следствием активации собственного апоптозного аппарата клеток.
Таблица 1.