Витамин в12.
Биологическая роль. Витамин В12 - водорастворимый витамин, играет важную роль в функционировании мозга и нервной системы, участвует в образовании клеток крови. Регулирует синтез и процессинг ДНК, жирных кислот, энергетический обмен. Добавление витамина к кормам способствует более полноценному усвоению растительных белков и повышает продуктивность сельскохозяйственных животных на 10 - 15%.
Описание. Витамин B12 (Цианокобаламин) - кристаллический порошок темно-красного цвета, без запаха. Трудно растворим в воде, растворим в этаноле.
Молекула цианокобаламина (рис. 2) содержит кобальт-корриновую систему, в которой ион кобальта (Со3+) связан с макроциклом сильно напоминающим порфириновое ядро гема, который и обуславливает окраску витамина. Вторая кольцевая структура - азотистое основание — 5,6-диметилбензимидазол (5,6 ДМБ). 5,6 ДМБ соединен с первой кольцевой системой гетерогенной боковой цепью, состоящей из N-амино-2-пропанола (изопропанола), этерифицированного фосфатом 3-мононуклеотида, связанного с основанием 5,6 ДМБ N-гликозидной связью.
Рис. 2. Химическая структура витамина В12.
Витамин В12 химически наиболее сложный и объемный витамин, открыт в 1948 г. одновременно в США и Англии. В 1972 г. Роберт Вудворд (США, Бостон) и Альберт Эшенмозер (Германия, Цюрих) опубликовали работу по синтезу В12. Вудворд с командой из почти 100 студентов и аспирантов с начала 1960-х годов трудились над синтезом этой молекулы. Синтез включал почти 100 стадий, каждая из которых тщательно планировалась и анализировалась, что было характерно для всех работ Роберта Вудворда. И хотя Вудворд показал, что синтез любого сложного вещества возможен при достаточном времени и разумном планировании, в настоящее время витамин В12 получается только биотехнологическим методом.
Мировое производство витамина В12 сосредоточено в четырех компаниях. Французская компания Sanofi-Aventis и три китайских производителя продают до 35 тонн витамина в год.
Продуценты: В настоящее время основными продуцентами витамина В12 являются Pseudomonas denitrificans and Propionibacterium shermanii, а также актиномицеты, метанообразующие и фотосинтезирующие бактерии, одноклеточные водоросли, пропионовокислые бактерии (14 видов). Ранее использовался Streptomyces griseus. Во всех случаях независимо от используемого штамма и условий культивирования в среду вводят ионы кобальта и часто 5,6 ДМБ.
Получение витамина в12 с помощью пропионовокислых бактерий
В настоящее время для получения витамина В12 используют Prop. Shermanii, их варианты и мутанты. Наибольший интерес представляют штаммы, способные к самостоятельному синтезу 5,6-диметилбензимидазола (5,6 ДМБ). Поскольку синтез 5,6 ДМБ лучше происходит при доступе воздуха, осуществляют двустадийный процесс, в котором получают наиболее высокий выход продукта. На 1-й стадии культуру выращивают в анаэробных условиях до полной утилизации сахара. На 2-й стадии включают аэрацию, тем самым создавая условия для синтеза 5,6 ДМБ. При этом стимулируется наработка витамина. Без 5,6-ДМБ синтезируется псевдокобаламин, содержащий азотистое основание аденин. Если бактерии не синтезируют 5,6-ДМБ, его добавляют на второй стадии ферментации.
Обе стадии осуществляют в двух разных ферментерах или в одном. Анаэробно выросшие клетки можно отделить центрифугированием и инкубировать густую суспензию на воздухе и, если нужно, в присутствии 5,6 ДМБ и цианида.
Среда для ферментации обычно содержит глюкозу или инвертированную-мелассу (10 - 100 г/л), небольшие количества солей Fe, Mn и Mg, а также нитрат кобальта (10 - 100 мг/л), источники азота. В среду добавляют кукурузный экстракт (30 - 70 г/л), содержащий молочную и пантотеновую кислоты, усиливающие рост бактерий. Пантотеновую кислоту, стимулирующую также синтез витамина, рекомендуют вносить в среду дополнительно.
Условия культивирования. Бактерии культивируют при 30°, поддерживая рН на уровне 6,5 - 7,0. В процессе ферментации образуются органические кислоты, их нейтрализуют, добавляя аммиак. Ферментацию производят в ферментерах на 500 л, содержащих 340 л среды, инокулированных 7 л посевного материала. В первые 80 ч культура растет под небольшим давлением азота и слабым перемешиванием (без аэрации), в следующие 88 ч включают аэрацию (2 м3/ч) и перемешивание.
Возможны некоторые вариации в культивировании. Если бактерии не синтезируют 5,6 ДМБ, их культивируют в строго анаэробных условиях без доступа кислорода около 72 ч. Далее через 3 суток в среду добавляют предшественник витамина 5,6-диметилбензимидазол и продолжают ферментацию еще 3 суток. Общая продолжительность ферментации -6 суток
Выделение витамина В12.
Цианкобаламин накапливается в клетках бактерий, поэтому необходимы операции по выделению витамина. Проводят сепарирование клеток, экстрагирование водой при рН 4,5—5,0 и температуре 85—90°С, в присутствии стабилизатора (0,25% раствор натрия нитрита). Экстракция протекает в течение часа, после чего водный раствор охлаждают, нейтрализуют раствором едкого натра, добавляют коагулянты белка – FeCl3 и Al2(SO4)3 с последующим фильтрованием, фильтрат упаривают и дополнительно очищают, используя методы ионнообменную хроматографию, после чего проводят кристаллизацию витамина при 3 - 4°С из водно-ацетонового раствора.
Кристаллический цианкобаламин можно получать с помощью резорцина или фенола, образующих с ним аддукты которые сравнительно легко разлагаются на составляющие компоненты.
При реализации данного биотехнологического процесса не забывать о высокой светочувствительности витамина B12, поэтому все операции необходимо проводить в затемненных условиях (или при красном свете).
Выход витамина B12 при использовании пропионовокислых бактерий – до 60 мг/л.
Основными направлениями совершенствования штаммов микроорганизмов-продуцентов цианокобаламина являются: увеличение продуктивности штаммов микроорганизмов методами мутагенеза и селекции; увеличение продуктивности штаммов микроорганизмов методом слияния протопластов; увеличение продуктивности штаммов-продуцентов методом генной инженерии; создание штаммов-продуцентов, секретирующих витамин в культуральную жидкость; создание штаммов-продуцентов, растущих на средах из непищевого сырья.
Аскорбиновая кислота (витамин С)
Биологическая роль. Аскорбиновая кислота – природное соединение, обладающее свойствами антиоксиданта (рис. 3)..
Рис. 3. Химическая структура витамина С.
Аскорбиновая кислота – белый порошок, хорошо растворима в воде, ее водные растворы имеют кислую реакцию среды
Получение аскорбиновой кислоты
В настоящее время для крупномасштабного производства L-аскорбиновой кислоты (витамина С) используют процесс, разработанный в Китае в 1960-х годах и модернизированный в 90-х. Этим методом в Китае получают около 80% мирового производства аскорбиновой кислоты. Способ включает две микробиологические стадии и несколько химических. Исходным субстратом для кислоты аскорбиновой является D-глюкоза (рис. 4).
На первом этапе (химическом) глюкоза подвергается каталитическому гидрированию до спирта сорбитола. Сорбитол окисляется до сорбозы с участием бактерий рода Acetobacter. Далее с участием другого микроорганизма Erwinia сорбоза окисляется до 2-кето-L-гулоновой кислоты (2-KGА). На последнем (химическом) этапе этого процесса 2-кето-L-гулоновая кислота (2-KGА) подвергается дегидратации и лактонизации, образуется циклический лактон - L-аскорбиновая кислота.
Рис. 4. Основные стадии производства кислоты аскорбиновой
1: D-Глюкоза; 2: D-Сорбит; 3:L-Сорбоза; 4: 2-Кето-L-гулоновая кислота; 6: L-Аскорбиновая кислота
Таким образом, производство кислоты аскорбиновой осуществляется с участием двух микроорганизмов – Acetobacter и Erwinia. Совместное культивирование этих микроорганизмов оказалось невозможным из-за разных питательных сред, а последовательное – невыгодным.
Американские и китайские биоинженеры в настоящее время соревнуются, кто быстрее создаст мутантный организм, способный за одну стадию превращать глюкозу сразу в 2-KGA, минуя стадию восстановления глюкозы до сорбитола.
Глик и Пастернак приводят пример, что методами генетической инженерии получен рекомбинантный штамм микроорганизма Erwinia herbicola со встроенным геном 2,5DKG-редуктазы из Corynebacterium. Таким образом трансформированный штамм Erwiniа используется как фабрика, заменяющая 2-х стадийный процесс производства L- аскорбиновой кислоты с участием 2-х микроорганизмов на одностадийный.