40)Биосинтез пуриновых и пиримидиновых.

Синтез начинается с образования 5-фосфорибозил-1 -амина из рибозо-5-фосфат (АТФ-АМФ) получается 5-фосфорибозил- 1-дифосфат (гпутамин-глутомат\Н4Р2О7) 5-фосфорибозиламин.

затем к аминогруппе присоединяется остаток глицина и далее ; последовательно протекают реакции ооразования пуринового ядра с использованием метешгаьной группы метенил-Н4фолата, еще одной амидной группы пгутамина, диоксида углерод , аминогруппы аспарагиновой кислоты, формнльного остатка формил-Н4-фолата. Результатом этой серии реакций является образование инозиновой кислоты (ИМФ).

Инозиновая кислота - это нуклеотид, пуриновая часть которого представлена гипоксантином: она встречается

в составе тРНК в качестве одного из минорных нуклеотидов. Кроме того, инозиновая кислота служит предшественником основных пуриновых нукпеотидов - АМФ и ГМФ, схема синтеза которых представлена . При действии специфических киназ эти нуклеозидмонофосфаты превращаются в нуюгеозиддифосфаты и нуклеозидтрифосфаты.Следуюшим образом а)инозиновая к-та ( аспартат/ ГТФ-ГДФ+ НЗРО4) аленилоянтарная к-та (-фумарат) адениловая к-та (АТФ-АДФ) АДФ-АТФ б) инозиновая к-та (НЮ/ НАД+-НАДН+Н+) ксантиловая к-та (Н2О/ глутомин -глутомат, АТФ-АМФ+Н4Р2О7 ) гуаниловая к-та (АТФ-АДФ) ГДФ (АТФ-АДФ ) ГТФ.

Пиримидиновое ядро пиримидиновых пуклеогидов образуется из диоксида углерода, амидной группы глутамина, аспарагиновой кислоты. В результате цепи реакций из этих веществ синтезируется уридинмонофосфорная кислота, которая в свою очередь служит предшественником других пиримидиновых нуклеотидов — цитидиловых и тимидиловых.

Биосинтез уридиловон кислоты. Первая реакция пути синтеза УМФ — это образование карбамоилфосфата при действии кар бамоилфосфатсинтетазы II (точнее, при действии карбамоилфосфатсинтетазного активного центра 1юлиф>нкцнон!ии>жмх> фермеша). Б зтой реакции ЫН2-1рушш кароамиилфисфт'а образуется за счет амидной lyyjuibj пгутамина:

СО2 + Глутамин + 2АТФ + Н2О-» H2N-CO-OPO3H2 + Глутамат + 2АДФ + НЗРО4

Напомним, что при синтезе мочевины в реакции, катализируемой карбамоилфосфатсинтетазой 1, используется аммиак, а не глутамин. Эти ферменты различаются также локализацией:

карбамоилфосфатсинтетаза 1 содержится в митохондриях, главным образом в печени, а карбамоилфосфатсинтетаза II—в цитозоле, практически во всех клетках организма.

Далее карбамоилфосфат в реакции с аспарагиновой кислотой образует карбамоиласпарагиновую кислоту, которая денатурируется с образованием пиримидинового цикла дигидрооротовой кислоты:

Первые три реакции—образование карбамоилфосфата, карбамоиласпартата и дигидрооротовой кислоты— катализируются одним белком, содержащим активные центры для катализа каждой из реакций, Карбамоилфосфат и карбамоиласпартат не освобождаются из фермент-субстратного комплекса; освобождающимся продуктом действия

этого белка является дигидрооротовая кислота, Следовательно, Карбамоилфосфат, образующийся при синтезе УМФ,

не может быть использован для синтеза мочевины.

Дигидрооротовая кислота при действии отдельного фермента (дегидрогеназы) превращается в оротовую кислоту. Две следующие реакции—образование оротидиловой кислоты и ее декарбоксилирование—катализируются также одним белком. Таким образом, шесть активных каталитических центров, необходимых для синтеза пиримидиновых нуклеотидов, кодируются только тремя структурными генами.

Биосинтез цитидиловых иуклеотндов. Из УМФ при действии специфических киназ образуются УДФ и УТФ: УМФ + АТФ -» УДФ + АДФ УДФ + АТФ -> УТФ + АДФ Путем аминирования УТФ образуется цнтидинтрифосфорная кислота, в этой

Более сложным путем из уридиловой кислоты (а также из цитидиловой кислоты) образуются тимидиловые нуклеотиды.

Синтез УМФ регулируется по механизму отрицательной обратной связи: УТФ является аллостерическим ингибитором первого фермента этой метаболической цепи — карбамоилфосфат-синтетазы II. Этот механизм предотвращает избыточный синтез не только УМФ, но и всех других пиримидиновых нуклеотидов, поскольку они образуются из УМФ.

41 Катаболизм пуриновых нуклеотидов приводит к образованию ксантина, который в организме человека превращается в мочевую кислоту. Часть свободных пуриновых оснований используется повторно (реутилизация) под действием ферментов гипоксантин-гуанин-фосфорибозиттрансферазы и аденинфосфорибозилтрансферазы, которые превращают пуриновые основания в нуклеотиды. Донором фосфорибозильной группы служит 5’-фосфорибозил-1’-пирофосфат (PRPP). Гиперурикемия - состояние, проявляющееся повышением содержания мочевой кислоты в крови. Причинами гиперурикемии может быть: - избыточный синтез мочевой кислоты вследствие нарушения регуляции -снижение в плазме концентрации уратсвязывающего белка - транспортного белка для мочевой кислоты -замедление выведения мочевой кислоты с мочой -снижение скорости реутилизации пуриновых оснований. Подагра - заболевание, причиной которого является гиперурикемия. Так как мочевая кислота плохо растворимое соединение, то при повышении концентрации происходит ее кристаллизация и накопление в суставах под кожей или в виде почечных камней. Способом, снижающим синтез мочевой кислоты, является применение в качестве лекарства аллопуринола - конкурентного ингибитора ксантиноксидазы, фермента, катализирующего превращение гипоксантина в ксантин и ксантина в мочевую кислоту. В результате катаболизм нуклеотидов приводит к образованию гипоксантина, который является более растворимым веществом. Синдром Леша-Нихана - генетическое заболевание, связанное с повышением у детей синтеза мочевой кислоты и, как следствие этого, развитием различных нейрофизиологических нарушений: замедлению умственного развития, агрессивности и т.д. Причиной этого является дефект фермента гипоксантин-гуанин-фосфорибозил-трансферазы , который катализирует реутилизацию гуанина и гипоксантина. В этом случае образуется больше ксантина и, следовательно, мочевой кислоты. Кроме того, снижение синтеза GMP и IMP из свободных оснований ухудшает регуляцию скорости их синтеза из мелких фрагментов путем реутилизации.

Катаболизм пиримидиновых нуклеотидов приводит к образованию пиримидиновых оснований, а затем протекает разными путями в зависимости от вида организма. У человека конечными продуктами распада являются СО₂, NН₃,  -аланин (из урацила) и  -иминомасляная кислота из тимина. Ферменты реутилизации свободных пиримидиновых оснований не были обнаружены, но клетки млекопитающих обладают способностью реутилизировать пиримидиновые рибонуклеозиды - уридин и цитидин, превращая их в соответствующие нуклеотиды.

Реутилизация пуриновых оснований Свободные пуриновые и пиримиди-новые основания непрерывно образуются в клетках в результате описанного выше метаболического распада нуклеотидов. Значительная часть этих свободных пуриновых оснований не подвергается дальнейшему распаду, а реутилизирует-ся, т.е. используется вновь для синтеза пуриновых нуклеотидов. В этом случае нуклеотиды образуются совсем не так. как при биосинтезе de novo, который мы рассмотрели выше. Пуриновое ядро аденина, синтезирующееся de novo, строится на рибозо-5-фосфате этап за этапом, в длинной последовательности реакций. Путь биосинтеза из готовых продуктов гораздо проще. Он включает всего лишь одну реакцию, в ходе которой свободный аденин взаимодействует с          5-фосфорибозил-1-пирофосфатом (ФРПФ), что и приводит к образованию аденинового нуклеотида Аденин + ФРПФ -»• AMP + РР,. Свободный гуанин реутилизируется тем же путем при помощи другого фермента Гуанин + ФРПФ — GMP + РР_;.

42 Биосинтез белка проходит в 4 этапа: 1 этап. Транскрипция – передача информации о структуре белка из молекулы ДНК для и-рнк. Этот дело осуществляется с участием специальных ферментов и происходит так: двойной ряд в определенном отрезке разъединяется и вдоль одной из цепей ДНК начинается синтез молекулы и-рнк сообразно принципу комплементарности. Определен отруб ДНК (ген) матрицей для соответствующей и-рнк. Слайсинг – из новообразованной и-рнк вырезаются неинформационные фрагменты – интроны и сшиваются информационные участки – экзоны. Екзоны – последовательность нуклеотидив в генах, которые кодируют синтез белка (информативный участок). Интроны – последовательность нуклеотидив ДНК, которые не кодируют синтез белка (неинформативный участок). Сплайсеры – отрезок ДНК, который не несет генетическую информацию. Синтезированые молекулы и-рнк переходят из ядра в цитоплазму, а ДНК возобновляет свою структуру.

ІІ этап. Активация аминокислот. Этот дело происходит в цитоплазме. Активированые молекулы аминокислот соединяются с молекулами транспортных РНК, каждой из 20 аминокислот отвечает определенная т-рнк. В молекуле т-рнк есть два важных участка: к одной из них прикрепляется соответствующая аминокислота, а другая содержит триплет нуклеотидив, который отвечает коду данной аминокислоты в молекуле и-рнк. Активированы еаминокислоты, соединенные из т-рнк поступают к рибосомам.

ІІІ этап. Трансляция – синтез полипептидних цепей. Происходит так: молекула и-рнк двигается между двумя субединицами рибосом и к ней последовательно присоединяются молекулы т-рнк с аминокислотами. При этом сообразно принципу комплементарности кодоны и-рнк вступают в взамодействие с антикодонами т-рнк. Последовательность расположения аминокислот определяется последовательностью триплетов в молекуле и-рнк. Аминокислоты образуют пептидные связки впоследствии энергии АТФ и в результате из рибосоми всходит полипептидная цепь.ІV этап. Терминация – процесс образования вторичной и третичной структур белковой молекулы. Этот этап осуществляется в цитоплазме путем скручивания, свертывания полипептидов. Молекулярные болезни - понятие ввёл американский химик и физик Лайнус Карл Полинг, (Pauling Linus Carl, род. в 1901 г.). Обозначает болезни, вызываемые нарушением синтеза того или иного белка или образованием функционально неполноценных белков вследствие нарушения последовательности аминокислот в полипептидной цепи.

43 Процесс образования молекулы мРНК на матрице ДНК – биогенез мРНК – в прокариотических клетках представляется относительно простым и включает главным образом транскрипцию соответствующего гена при участии РНК-полимеразы. Во многих случаях первичным продуктом экспрессии гена является молекула мРНК, уже способная к функционированию, т.е. у прокариот транскрипция и трансляция являются сопряженными процессами. Биосинтез тРНК у прокариот из первичного тРНК транскрипта проходит стадию процессинга аналогично синтезу мРНК и тРНК у эука-риот. Биогенез мРНК у эукариот существенно отличается не только механизмом регуляции транскрипции, но и многоступенчатостью формирования активной молекулы. До открытия феномена сплайсинга мРНК было известно, что многие мРНК эукариот синтезируются в виде гигантских высокомолекулярных предшественников (пре-мРНК), которые уже в ядре подвергаются посттранскрипционному процессингу. Предполагали, что процессинг включает удаление длинных 5'- и 3'-концевых участков, которые якобы выполняют регуляторные функции. Как оказалось, ген эукариот является не непрерывной, а мозаичной структурой, содержащей наряду с кодирующими (экзоны) также некодирующие (интроны) последовательности. Фермент РНК-полимераза катализирует транскрипцию как экзонов, так и интронов с образованием гетерогенной ядерной РНК (гяРНК), называемой также первичным транскриптом. Термин «интроны» означает вставочные, нетранслирующие последовательности нуклеотидов в ДНК эукариот. Этот термин применим и к вставочным нуклеотидным последовательностям первичного РНК-транскрипта. С открытием интрон-экзонного строения генов, характерного для эукариотических клеток, начался новый этап исследований на пути реализации генетической информации. Транскрипция гена, состоящего из чередующихся кодирующих и некодирующих нуклеотидных последовательностей, обеспечивала полное его копирование и приводила к синтезу РНК-предшественника. Поэтому было высказано предположение о существовании между транскрипцией и трансляцией еще одного важного звена – образования пригодной для трансляции «зрелой» молекулы мРНК. Этот этап получил название процессинга, или созревания, мРНК. К настоящему времени считается установленным, что процессинг мРНК включает три основных процесса: 1) кэпирование – химическая модификация 5'-концевой последовательности мРНК; 2) сплайсинг – удаление некодирующих интронных последовательностей из мРНК и сшивание образующихся экзонов; 3) полиаденилирование – химическая модификация 3'-концевой последовательности мРНК. В осуществлении каждого из указанных процесов специфическое участие принимает ряд белков и нуклеиновых кислот, хотя конкретные молекулярные механизмы этих превращений еще не полностью раскрыты. Все три указанных процесса имеют важное значение в формировании зрелой молекулы мРНК. Однако наибольший интерес исследователи проявляют к выяснению молекулярного механизма сплайсинга, который должен обеспечить, во-первых, постепенное и высокоточное вырезание интронов из первичного транскрипта и, во-вторых, сшивание образующихся фрагментов – экзонов – «конец в конец». Любые отклонения или смещения границ в процессе вырезания интронов и сшивания экзонов даже на один нуклеотид могут привести не только к глубокому искажению смысла в кодирующих последовательностях, но и к нарушению передачи генетической информации и развитию патологии. Последовательность нуклеотидов в молекуле мРНК обычно начинается с пары 5'-ГУ и заканчивается парой АГ-3'. Эти последовательности, вероятнее всего, служат сайтами (местами) узнавания для ферментов сплайсинга. Поскольку 5'-ГУ ... АГ-3' последовательности не открыты в молекулах предшественников тРНК, было высказано предположение о существовании по меньшей мере двух типов ферментов сплайсинга; одного для мРНК и другого для тРНК. Имеются, кроме того, достоверные данные о том, что интроны часто оказываются длиннее экзонов и что внутри гена на интроны приходится значительно большая часть нуклеотид-ных пар. Подсчитано, например, что ген овальбумина содержит 7 интронов, в общей сложности насчитывающих 7700 пар оснований, в то время как сформировавшаяся после сплайсинга мРНК насчитывает всего 1859 оснований. Почти во всех эукариотических клетках синтезированные на структурных генах первичные транскрипты подвергаются процессингу, прежде чем выполнят свои уникальные функции в белковом синтезе. Во многих случаях процессинг имеет место главным образом в ядре, хотя этот процесс продолжается и после транспортировки молекул РНК из ядра в цитоплазму: например, терминальные реакции полиаденилирования и метилирования остатков нуклеозидов. Химический смысл кэпирования сводится к присоединению остатка 7-метилгуанозина посредством трифосфатной группы к 5'-концу молекулы транскрипта, метилированию 2'-ОН-группы первого и второго нуклеотидов на 5'-конце мРНК. Полиаденилирование 3'-конца первичного транскрипта включает ряд стадий и участие эндонуклеазы и полиаденилатполимеразы. Эндонуклеаза расщепляет мРНК вблизи специфической сигнальной последовательности (5')ААУААА(3'), отличающейся высокой консервативностью. Полиаденилатполимераза синтезирует поли-А-конец (от 20 до 250 нуклеотидов) начиная с точки распада. Функции 5'-кэп и 3'-поли-А раскрыты недостаточно полно. Показано, что 5'-кэп, соединяясь со специфическим белком, принимает участие в связывании мРНК с рибосомой, способствуя инициации синтеза белка. Допускают, что основное назначение 5'-кэп и поли-А – защита мРНК от энзиматического распада. Известно также, что не все цитоплазматические мРНК содержат участки поли-А на 3'-концах и что в цитоплазме клеток животных происходит как присоединение, так и удаление участка поли-А из молекулы мРНК. Следует отметить, что размер молекулы цитоплазма-тической мРНК даже после удаления 3'-поли-А оказывается все же намного большим, чем требуется для синтеза кодируемого белка. В частности, размер мРНК белка глобина (эритроциты кролика) составляет 550 нуклео-тидов, в то же время кодирующий участок состоит из 430 нуклеотидов (размер поли-А – 40 нуклеотидов). Другой пример: размер мРНК тяжелого иммуноглобулина (из клеток миеломы мышей) составляет 1800 нуклеотид-ных остатков, а кодирующая часть – 1350 нуклеотидов (размер поли-А – 150–200 нуклеотидов). Интересно, что большинство указанных процессов, если не все, могут регулироваться независимо, изменяя уровень экспрессии гена. Более того, даже после завершения формирования мРНК изменения ее стабильности могут оказывать существенное влияние на экспрессию гена. В последние годы интенсивно исследуются структура и назначение нетранслируемых участков генов – интронов. Они различаются по числу, размерам и топографии. Показано, например, что ген сывороточного альбумина хотя и содержит всего 6 интронов, но на их долю приходится до 80% этого гена; интроны имеют размеры от 90 до 20000 нуклеотидных пар. Ген коллагена содержит более 50 интронов. Исключение составляют лишь гены, кодирующие гистоны, не содержащие интронных структур. Различают 4 класса интронов. Первый класс открыт как в ядерных, так и в митохондриальных генах, кодирующих рибосомные рРНК; второй класс интронов открыт в первичных транскриптах митохондриальных матричных мРНК. Оказалось, что оба эти класса интронов не нуждаются ни в источнике энергии, ни в участии ферментов, но наделены способностью самосплайсинга. Третий – самый большой класс интронов обнаружен в первичных транскриптах ядерных мРНК, подвергающихся созреванию. Сплайсинг требует наличия комплекса белков и особой группы клеточных РНК, названных малыми ядерными РНК (мяРНК). Выделено и охарактеризовано 5 групп богатых уридином мяРНК, соответственно обозначаемых U1, U2, U4, U5 и U6, размерами от 100 до 200 нуклеотидов. Комплексы мяРНК и белков, названные малыми ядерными нуклеопро-теинами, объединяются в единую систему – сплайсосому, координирующую весь процесс сплайсинга. Предполагают, что мяРНК соединяются с обеими концами интрона, способствуя формированию специфической конформации, необходимой для узнавания ее участвующими в процессе ферментами, сближению двух экзонов, удалению интронов и воссоединению кодирующих экзонов. Четвертый класс интронов открыт в ряде тРНК. Сплайсинг этой группы интронов требует доставки энергии и присутствия эндонуклеаз и лигаз, катализирующих соответственно разрыв фосфодиэфирных связей с 5'- и 3'-концов интрона и соединяющих два экзона. В нетранскрибируемых последовательностях генома перед экзон-интронами открыты специфические участки, названные промоторами, а также энхансерами (повышающие уровень транскрипции) и силан-серами (ослабляющие уровень транскрипции). При взаимодействии с белками они выполняют функции регуляторных сигналов при транскрипции. Этот способ регуляции широко используется клетками эукариот как в процессах дифференцировки, так и при индукции репрессии.

44 .Репарация — особая функция клеток, заключающаяся в способности исправлять химические повреждения и разрывы в молекулах ДНК, повреждённой при нормальном биосинтезе ДНК в клетке или в результате воздействия физическими или химическими агентами. Осуществляется специальными ферментными системами клетки. Ряд наследственных болезней (напр., пигментная ксеродерма) связан с нарушениями систем репарации. Устройство системы репарации: - фермент, "узнающий" химически изменённые участки в цепи ДНК и осуществляющий разрыв цепи вблизи от повреждения - фермент, удаляющий повреждённый участок

-фермент (ДНК-полимераза), синтезирующий соответствующий участок цепи ДНК взамен удалённого -фермент (ДНК-лигаза), замыкающий последнюю связь в полимерной цепи и тем самым восстанавливающий её непрерывность