Історія дослідження

Термін «фермент» був запропонований у 17 столітті хіміком ван Гельмонтом для опису механізмів травлення. В кінці 18 — на початку 19 століття вже було відомо, що м'ясо перетравлюється шлунковим соком, а крохмаль перетворюється на цукор під дією слини. Проте механізм цих явищ був ще невідомий^[1]. В 19 столітті Луї Пастер, вивчаючи перетворення вуглеводів в етиловий спирт під дією дріжджів, дійшов до висновку, що цей процес (бродіння) каталізується якоюсь «життєвою силою», що знаходиться в дріжджових клітинах.

Понад сто років тому терміни «фермент» і «ензим» відображали різні погляди Луї Пастера з одного боку та Марселена Бертло і Юстуса Лібіха з іншого в теоретичній суперечці про природу спиртового бродіння. Власне «ферментами» (від лат. fermentum — «закваска») називали «організовані ферменти» (тобто саме живі мікроорганізми), а термін «ензим» (від грец. ἐν- — «в-» і ζύμη — «дріжджі», «закваска»), запропонований 1876 року В. Кюне для «неорганізованих ферментів», що секретуються клітинами, наприклад, до шлунку (пепсин) або кишечника (трипсин, амілаза). За два роки по смерті Пастера 1897 року Едуард Бюхнер опублікував роботу «Спиртове бродіння без дріжджових клітин», в якій експериментально показав, що екстракт клітин дріжджів здійснює спиртове бродіння так само, як і незруйновані дріжджові клітини^[2] 1907 року за цю роботу він був удостоєний Нобелівської премії.

Функції ферментів

Ферменти є біологічними каталізаторами, вони присутні у всіх живих клітинах і сприяють перетворенню одних речовин (субстратів) на інші (продукти). Ферменти виступають в ролі каталізаторів практично у всіх біохімічних реакціях, що відбуваються в живих організмах — ними каталізується біля 4000 хімічно окремих біореакцій^[3]. Ферменти грають найважливішу роль у всіх процесах життєдіяльності, скеровуючи та регулюючи обмін речовин організму.

Подібно до всіх каталізаторів, ферменти прискорюють як пряму, так і зворотну реакцію, знижуючи енергію активації процесу. Хімічна рівновага при цьому не зміщується ні в прямий, ні у зворотний бік. Відмінність ферментів від небілкових каталізаторів полягає у їхній високій специфічності — константа дисоціації деяких субстратів з білком-ферментом може досягати менш ніж 10⁻¹⁰ моль/л.

Ферменти широко використовуються і в народному господарстві — харчовій, текстильній промисловості, у фармакології.

Структура і механізм дії ферментів

Активність ферментів визначається їхньою тривимірною структурою^[4].

Як і всі білки, ферменти синтезуються у вигляді лінійного ланцюжка амінокислот, який згортається певним чином. Кожна послідовність амінокислот згортається особливим чином, і молекула (білкова глобула), що виходить, володіє унікальними властивостями. Кілька білкових ланцюжків можуть об'єднуватися у білковий комплекс. Найбільші рівні структури білків — третинна та четвертинна структури — руйнуються при нагріванні або під дією деяких хімічних речовин.

Щоб каталізувати реакцію, фермент повинен зв'язатися з одним або кількома субстратами. Білковий ланцюжок ферменту згортається таким чином, що на поверхні глобули утворюється щілина або западина, до якої приєднуються молукули субстрату. Ця область називається ділянкою (сайтом) зв'язування субстрата. Зазвичай вона співпадає з активним центром ферменту або знаходиться поблизу від нього. Деякі ферменти містять також ділянки зв'язування кофакторів або іонів металів.

У деяких ферментів присутні також ділянки зв'язування малих молекул, що не беруть безпосередньої участі в реакції і часто, але не обов'язково, є субстратами або продуктами метаболічного шляху, в який входить фермент. Вони зменшують або збільшують активність ферменту, що створює можливість для зворотного зв'язку або регуляції роботи ферменту.

Выводы:

Ферменты характеризуются следующими основ­ными свойствами.

1. Все они представляют собой глобулярные белки.

2. Информация о них, как и о других белках, закодирована в ДНК.

3. Ферменты действуют как катализаторы.

4. Их присутствие не влияет ни на природу, ни на свойства конечного продукта реакции.

5. Ферменты действуют чрезвычайно эф­фективно, т. е. очень малое количество фермента вызывает превращение боль­ших количеств субстрата. Одна молеку­ла каталазы способна, например, при температуре тела разложить за одну се­кунду на воду и кислород около 600 ты­сяч молекул пероксида водорода.

6. Ферменты высокоспецифичны, т. е. один фермент катализирует обычно только од­ну реакцию. Каталаза, например, катализирует только расщепление пероксида во­дорода.

7. Катализируемая ферментом реакция об­ратима.

8. Активность ферментов меняется в зависи­мости от рН и температуры, а также от концентрации как субстрата, так и самого фермента.

9. Ферменты снижают энергию активации катализируемой реакции .

1 0. В молекуле фермента есть активный центр, который вступает в контакт с суб­стратом. Этот активный центр имеет осо­бую форму.

Энергия активации

Представим себе смесь бензина и кислорода. Реакция между этими двумя веществами с тер­модинамической точки зрения возможна, но она не пойдет без затраты некоторого количества энергии, поступившей, например, в фор­ме простой искры. Так же обстоит дело и со спичкой. Содержащиеся в спичечной головке вещества могут вступить в реакцию, суммар­ным итогом которой будет выделение энергии, но чтобы запустить реакцию, придется сначала затратить небольшое количество энергии (до­статочно тепловой энергии, выделяющейся, когда мы чиркаем спичкой о коробок). Энер­гия, необходимая для того, чтобы заставить ве­щества вступить в реакцию, называется энер­гией активации. Ферменты, действуя как ката­лизаторы, снижают энергию активации (рис.). Они повышают общую скорость ре­акции, не изменяя в сколько-нибудь значи­тельной степени температуру, при которой эта реакция протекает.

М еханизм действия ферментов

Ферменты обладают очень высокой специ­фичностью. Фишер (Fischer) в 1890 г. выска­зал предположение, что эта специфичность обусловливается особой формой молекулы фермента, точно соответствующей форме мо­лекулы субстрата (или субстратов). Эту гипо­тезу часто называют гипотезой «ключа и зам­ка»: субстрат сравнивается в ней с «ключом», который точно подходит по форме к «замку», т. е. к ферменту. В схематическом виде это представлено на рис. Часть молекулы фермента, вступающую в контакт с субстра­том, называют активным центром фермента, и именно активный центр фермента имеет осо­бую форму.

Образовавшиеся продукты по форме уже не соответствуют активному центру фермента. Они отделяются от него (поступают в окружающую среду), после чего освободившийся активный центр может принимать новые молекулы суб­страта.

В 1959 г. Кошланд (Koshland) предложил новую интерпретацию гипотезы «ключа и зам­ка», получившую название гипотезы «индуци­рованного соответствия». На основе данных, позволяющих считать ферменты и их актив­ные центры физически более гибкими, чем это казалось вначале, он заключил, что субстрат, соединяясь с ферментом, вызывает какие-то изменения в структуре его активного центра. Аминокислотные остатки, составляющие ак­тивный центр фермента, принимают опреде­ленную форму, которая дает возможность фер­менту наиболее эффективным образом выполнять свою функцию. Подходящей аналогией в этом случае может служить пер­чатка, которая при надевании на руку соответ­ствующим образом изменяет свою форму.

С корость ферментативных реакций

Мерой скорости ферментативных реакций слу­жит количество субстрата, подвергшегося пре­вращению в единицу времени, или количество образовавшегося продукта.

Скорость определяют по углу наклона каса­тельной к кривой на начальной стадии (а на рис.) реакции. Чем круче наклон, тем больше скорость. Со временем скорость реакции обыч­но снижается, по большей части в результате снижения концентрации субстрата (см. след. разд.).

Концентрация фермента

При высокой концентрации субстрата и при по­стоянстве других факторов, таких, например, как температура и рН, скорость ферментативной реакции пропорциональна концентрации фер­мента Катализ осуществляется всегда в условиях, когда концентрация фермента гораздо ниже концентрации субстрата. Поэтому с возра­станием концентрации фермента растет и ско­рость ферментативной реакции.

Температура

С повышением температуры ускоряется движе­ние молекул, вследствие чего у молекул субстра­та и фермента оказывается больше шансов стол­кнуться друг с другом. В результате увеличивает­ся и вероятность того, что реакция произойдет. Температура, обеспечивающая максимальную активность, называется оптимальной температу­рой. Если температура поднимается выше этого уровня, скорость ферментативной реакции сни­жается, несмотря на увеличение частоты столк­новений. Происходит это вследствие разруше­ния вторичной и третичной структур фермента, иными словами, вследствие того, что фермент претерпевает денатурацию (рис.). Молекула фермента развертывается и его активный центр постепенно утрачивает присущую ему форму. Наиболее чувствительны к воздействию высо­кой температуры водородные связи и гидрофоб­ные взаимодействия.

Температурный оптимум для большинства ферментов млекопитающих лежит в пределах 37—40 °С. Существуют, однако, ферменты с бо­лее высоким температурным оптимумом; у бак­терий, живущих в горячих источниках, он может, например, превышать 70^оС. Именно такие ферменты используются в качестве добавок к сти­ральным порошкам для стирки в горячей воде. Когда температура приближается к точке замер­зания или оказывается ниже ее, ферменты инактивируются, но денатурации при этом не проис­ходит. С повышением температуры их каталити­ческая активность вновь восстанавливается.

р Н

При постоянной температуре любой фермент, как правило, работает наиболее эффективно в узких пределах рН. Оптимальным считается то значение рН, при котором реакция протекает с максимальной скоростью. При более высоких и более низких рН актив­ность фермента снижается. Сдвиг рН меняет заряд ионизированных кислот­ных и основных групп, что ведет к разрушению ионных связей, участвующих в поддержании специфичной формы молекул фермента. В результате изменяется форма молекул фермента - и в первую очередь форма его активного центра. При слишком резких сдвигах рН фер­мент денатурирует.

Ингибирование ферментов

Известны различные низкомолекулярные соединения, которые могут снижать скорость ферментативных реакций. Такие соединения называются ингибиторами ферментов. Важно по­нимать, что ингибирование — это один из нор­мальных способов регулирования активности ферментов. Многие лекарственные препараты и яды также действуют как ингибиторы фермен­тов.

Кофакторы ферментов

Многим ферментам для эффективной работы требуются те или иные небелковые компоненты, называемые кофакторами. Кофакторы — это ве­щества, присутствие которых совершенно необ­ходимо для проявления каталитической актив­ности ферментов, хотя сами они в отличие от ферментов сохраняют стабильность при доволь­но высоких температурах. Роль кофакторов мо­гут играть различные вещества — от простых не­органических ионов до сложных органических молекул; в одних случаях они остаются неизмен­ными в конце реакции, в других — регенерируют в результате того или иного последующего процесса. Кофакторы подразделяются на три типа: неорганические ионы, простетические группы и коферменты. Их мы и рассмотрим в последую­щих трех разделах.

Неорганические ионы (активаторы ферментов)

Полагают, что эти ионы заставляют молекулы фермента или субстрата принять форму, способ­ствующую образованию фермент-субстратного комплекса. Тем самым увеличиваются шансы на то, что фермент и субстрат действительно проре­агируют друг с другом, а следовательно, возра­стает и скорость реакции, катализируемой дан­ным ферментом. Так, например, активность амилазы слюны повышается в присутствии хло­рид-ионов.

Простетические группы (например, ФАД, гем)

Если кофактор прочно связан с ферментом и остается в этом связанном состоянии постоян­но, то его называют простетической группой. Роль простетических групп играют органические молекулы. Они помогают ферменту осуществлять его ката­литическую функцию, как это видно на приме­ре флавинадениндинуклеотида (ФАД). ФАД содержит рибофлавин (витамин В₂), который является водород-акцепторной частью его мо­лекулы. Функция ФАД связана с окислительными путями клетки, в частности с процессом дыхания, в котором ФАД играет роль одного из переносчиков в дыхательной це­пи.

Гем — это железосодержащая простетическая группа. Его молекула имеет форму плоского кольца (порфириновое кольцо, такое же, как у хлорофилла), в центре которого находится атом железа. Гем выполняет в организме ряд биологи­чески важных функций.

ПЕРЕНОС ЭЛЕКТРОНОВ. В качестве простетической группы цитохромов (см. дыхательную цепь в гл. 9) гем выступает как переносчик электронов. Присоединяя электроны, железо восстанавливается до Fe(II), а отдавая их, окис­ляется до Fe(III). Гем, следовательно, принима­ет участие в окислительно-восстановительных реакциях за счет обратимых изменений валент­ности железа.

ПЕРЕНОС КИСЛОРОДА. Гемоглобин и миоглобин — два гемсодержащих белка, осуществляю­щих перенос кислорода. Железо находится в них в восстановленной, Fe(II), форме.

КАТАЛИТИЧЕСКАЯ ФУНКЦИЯ. Гем входит в состав каталаз и пероксидаз, катализирующих расщепле­ние пероксида водорода до кислорода и воды. Содержится он также и в некоторых других фер­ментах.

Коферменты (например, НАД, НАДФ, ацетилкофермент А, АТФ)

Коферменты, как и простетические группы, — это органические молекулы, выполняющие функцию кофакторов, но в отличие от простетических групп они сохраняют связь с ферментом только в ходе реакции. Все коферменты пред­ставляют собой производные витаминов.

Никотинамидадениндинуклеотид (НАД) — производное витамина ниацина («нико­тиновой кислоты») — может существовать как в окисленной, так и в восстановленной форме. В окисленной форме НАД при катализе играет роль акцептора водорода.