4.3 Вольтамперометрія.
Окрім хроматографії, недавно було продемонстровано, що бензоїлекгонін можна визначати за допомогою квадратно-хвильової вольтамперометрії (або її ще називають диференційною імпульсною вольтамперометрією) на крапаючому ртутному електроді в присутності фону 0,50 моль/л KNO3 при рН 9,2 завдяки відновленню естерної групи за цих умов. Також є відомості, що кокаїн теж можна визначати відновленням його на ртутному електроді в середовищі 0,05 М NaOH за умови попереднього адсорбційного концентрування. Тверді мікрочастинки кокаїну, механічно закріплені на парафіні і імпрегновані в графітовий електрод, можуть також слугувати для визначення кокаїну завдяки їх окисненню.
У середовищі фосфатного буферу при рН 7 кокаїн відновлюється і спостерігається один пік диференційної імпульсної полярограми при -1,490 В проти хлорсрібного електроду як електроду порівняння (в 3 М КСІ). При вищому рН спонтанно утворюється бензоїлекгонін як перший і головний продукт гідролізу кокаїну (рис. 12).
Рис. 12. Диференційні імпульсні вольтамперограми 3,5·10-5 моль/л кокаїну у фосфатному буфері при рН 7,0 (1) і 8,5 (2). Вольтамперограми (3) і (4) були отримані в середовищі 0,10 моль/л аміачного буферу при рН 10 та 0,01 моль/л NaOH відповідно. Експериментальні умови: частота зміни розгортки потенціалу 100 Гц, «висота» імпульсу 50 мВ та зміна скануючого потенціалу 1 мВ.
Також можливий подальший гідроліз до екгоніну, який є полярографічно неактивним. Метиловий естер екгоніну, інший продукт гідролізу кокаїну, також є полярографічно неактивним. Бензоїлекгонін є полярографічно активним завдяки відновленню неблокованої естерної групи, тому на диференційній імпульсній полярограмі з’являється пік в інтервалі потенціалів від -1,010 до -1,200 В, що відповідає бензоїлекгоніну і положення якого залежить від концентрації метаболіту. Таким чином пр. рН 8,5 полярографічне дослідження розчину кокаїну приводить до появи 2-х піків, що відповідають негідролізованому кокаїну та бензоїлекгоніну. Вплив бензоїлекгоніну на характер вольтамперометричного піку кокаїну наглядно продемонстровано на рис. 13.
Рис. 13. Диференційна імпульсна вольтамперограма 1·10-5 моль/л розчину кокаїну у середовищі фосфатного буферу при рН 8,5 (1). Концентрація бензоїлекгоніну, додана до розчину кокаїну, зростала у напрямку від 3,5·10-6, 6·10-6, 9·10-6, 1,95·10-5, 3,9·10-5 до 5,1·10-5 моль/л. Вольтамперограма (2) була отримана з розчину, що містив лише 8·10-5 моль/л бензоїлекгоніну в аналогічному буфері. Експериментальні умови: частота зміни розгортки потенціалу 100 Гц, «висота» імпульсу 50 мВ та зміна скануючого потенціалу 0,5 мВ.
Відновлення бензоїлекгоніну відбувається за складним механізмом димеризацації і наступного протонування. Найймовірнішим продуктами відновлення бензоїлекгоніну є екгонін і бензальдегід. Швидкість хімічної реакції лімітується концентрацією протонів в розчині електроліту.
Порівнюючи вольтамперометричні властивості кокаїну з бензоїлекгоніном і метиловим естером екгоніну, можна зробити висновок, природа електрохімічної активності кокаїну полягає в наявності тієї ж естерної групи, що і в бензоїлекгоніну. Основна відмінність між кокаїном і бензоїлекгоніном полягає в їх здатності до адсорбції на поверхні ртутного електроду. Бензоїлекгонін адсорбується сильніше, ніж кокаїн, тому на основі відновлення бензоїлекгоніну був розроблений метод інверсійного адсорбційного вольтамперометричного визначення кокаїну. Для цього як оптимальне середовище був вибраний 0,05 моль/л розчин NaOH, оскільки він забезпечує високу концентрацію бензоїлекгоніну внаслідок гідролізу кокаїну. Для оптимізації інструментальних параметрів, таких як частота зміни скануючого потенціалу і амплітуда, критерієм було вибране максимальне відношення Ір /Ер /2. Ір – це «висота» піку (значення сили струму і піці), Ер/2 – на півширина піку. За таких умов оптимальними виявились величини амплітуди на рівні 250 Гц і зміни скануючого потенціалу 50 мВ. На рис. 14 наведений вплив концентрації кокаїну на висоту вольтамперометричного піку. Накопичення проводили за 60 с при -0,500 В. Рівняння градуювального графіку: Ір (нА) = 26,827*Скок, моль/л + 20,023 (R = 0.9924). Межа виявлення кокаїну становила при цьому 2·10-9 моль/л. Відносне стандартне відхилення отриманих результатів знаходилось в межах від 0,9 до 3,2 % залежно від концентрації кокаїну (для десяти визначень).
Рис. 14. Залежність висоти вольтамперометричного піку від концентрації кокаїну у середовищі 0,05 моль/л розчину NaOH. Скокаїну, моль/л: 1 – 2,5·10-8; 2 - 7,5·10-8; 3 - 3,0·10-7; 4 - 7,0·10-7; 5 - 8,0·10-7; 6 - 1,0·10-6. Час накопичення 60 с при Е = -0,500 В, частота зміни розгортки потенціалу 250 Гц, «висота» імпульсу 50 мВ та зміна скануючого потенціалу 1 мВ. Із кожної вольтамперограми був вирахуваний фон.
Запропонований метод є швидким і простим для визначення кокаїну та бензоїлекгоніну. Чутливість методу є співмірною із хроматографічними методами. Важливою перевагою запропонованого електрохімічного методу визначення кокаїну є низька вартість інструментального обладнання і потрібних для аналізу хімічних речовин. Тим не менше, оскільки метод базується на адсорбційному накопиченні досліджуваних сполук на електроді до вольтамперометричного визначення, результати аналізу можуть бути хибними внаслідок наявності в розчині інших поверхнево-активних речовин. В такому випадку, вольамперометричному визначенню передує ще й процедура розділення речовин.
4.4. Мас-спектроскопія [15].
Зазвичай для розділення і визначення кокаїну і його головних метаболітів використовуються газова хроматографія і високоефективна рідинна хроматографія. Мас-спектроскопія і тандемна мас-спектроскопія в поєднанні з ГХ і ВЕРХ забезпечують високу селективність і чутливість визначення. ВЕРХ має деякі переваги перед ГХ, наприклад, аналіз без попередньої дериватизації. Час аналізу як при використанні ГХ, так і ВЕРХ, може бути досить великим. Тривалість аналізу та трудомістка пробо підготовка у випадку ГХ та ВЕРХ, особливо на стадії доочистки розчину перед ГХ-МС чи ВЕРХ-МС, приводять до великого часу, потрібного на аналіз однієї проби, що створює незручності при роботі з великою кількістю зразків.
Авторами [15] була розроблена швидка та високочутлива методика визначення кокаїну, бензоїлекгоніну, морфіну, 6-метилацетилморфіну і кодеїну в зразках волосся наркоманів за допомогою тандемної мас-спектроскопії з електроспрей-іонізацією. Висушені, перетерті пилеподібні зразки волосся (2 – 3 см) рівномірно розподілили в твердій матриці із оксиду алюмінію перемішуванням. Наркотики вимивали із матриці 4 мл 0,6 М розбаленої хлоридної кислоти, безпосередньо сполучена з нею колонка картриджу Oasis HLB забезпечувала розділення і концентрування. Картридж промивали водно-метанольним розчином амоній гідроксиду (78/20 /2), висушували під вакуумом 20 хв, додавали 2 мл оцтової кислоти і висушували досуха в потоці азоту. Розчиняли сухий залишок у 2 мл ацетонітрилу/води/мурашиної кислоти (80/19,875/0,125) для аналізу. Даний спосіб в поєднанні із запропонованою процедурою детектування називається matrix solid phase dispersion electrospray ionization-tandem mass spectrometry MSPD-ESI-MS/MS. Альтернативною була пробопідготовка за допомогою ультразвукового ферментативного гідролізу під дією Пронази Е. Після схожих процедур сухий залишок також розчиняли в аналогічному об’ємі розчинника. Це методика ultrasound enzymatic hydrolysis USEH–ESI-MS/MS.
Як внутрішні стандарти використовували d3-кокаїн і d3-бензоїлекгонін (5 мкг/мл) і дейтеровані опіати (50 мкг/мл). Автосамплером вводили 20 мкл проби, як розчинник використовували суміш ацетонітрилу/води/мурашиної кислоти (80/19,875/0,125) зі швидкістю потоку 60 мкл/хв.. Напруга потоку йонів становила 5000 кВ. Азот використовували як газ-розпилювач (20 psi), допоміжний (60 psi) і як захисний газ («газова завіса», 40 psi).
В режимі сканування катіонів кокаїн та бензоїлекгонін створюють [M+H]+ з m/z 304,2 і 290,3. Найбільші осколочні йони мали m/z 182,2 і 168,0 відповідно. Приклади мас-спектрів наведені на рис. 15.
Рис. 15. Повні мас-спектри кокаїну (а) та бензоїлекгоніну (в).
Досліджували вплив співвідношення кількості розчинників у суміші на інтенсивність сигналу наркотику при сталому вмісті (рис. 16).
Рис. 16. Вплив співвідношення ацетонітрил/вода та частки мурашиної кислоти на інтенсивність сигналу кокаїну і бензоїлекгоніну. С = 100 мкг/л.
Для кокаїну лінійний динамічний діапазон 1 – 28 мкг/г (RSD 4 – 7 %) бензоїлекгоніну 5 – 52 мкг/г (RSD 2 – 7 %). Межа виявлення кокаїну 2,1 нг/г, бензоїлекгоніну 2,2 нг/г; межа кількісного визначення становила 3,5 і 3,7 нг/г відповідно.
Кокаїн та опіати легко іонізуються за допомогою електроспрею в режимі сканування катіонів. Розроблена ЕСІ-МС/МС методика забезпечує високу чутливість визначення, особливо для кокаїну і бензоїлекгоніну. MSPD-ESI-MS/MS і USEH–ESI-MS/MS є точними та достовірними методами, результати визначення за якими перевірили методом ГХ-МС. Одночасне визначення заявленої кількості наркотиків проводять за 90 с. При використанні MSPD тривалість пробо підготовки становить 25 хв і 35 хв – при USEH. Таким чином, при рутинному аналізі в медично-судовій експертизі дані методики можуть забезпечити цікаву тенденцію: при збільшенні кількості досліджуваних зразків сумарний час аналізу на один зразок зменшується.