3. Метод скорости седиментации

Метод используется преимущественно для определения молекулярных масс макромолекул с небольшим коэффициентом поступательной диффузии, когда седиментация значительно преобладает над диффузией. Рассмотрим состояние макромолекулы в ячейке (рис.1). Через определенное время макромолекулы седиментируют равномерно и с одинаковой скоростью седиментации v. Это связано с тем, что силы, действующие на макромолекулу, уравновешиваются:

F =Fв +Fс. ( 1 )

Центробежная сила:

F = m^x = 4/3r³² x, ( 2 )

где m- масса макромолекулы; r- радиус макромолекулы; p- плотность макромолекулы; x - расстояние от оси вращения ротора.

Угловая скорость:

 = n/30 [c^-1], ( 3 )

где n – скорость вращения ротора, об/мин.

Выталкивающая сила:

Fв = m₀ ^ x = 4/3r^_ ^ x, ( 4 )

где m₀ – масса вытолкнутой жидкости; pо -плотность растворителя.

Разделим ( 2 ) на ( 4 ):

F /Fв =  /₀ ; Fв = F ₀ /. ( 5 )

Сила сопротивления:

Fc = f v, ( 6 )

где f - коэффициент внутреннего трения. Запишем (6) как F - Fв = Fс и выразим Fв через F , как в (3.33):

F - F (₀ /) = f v и

F (1 –  / ₀ ) = f v. ( 7 )

Подставив (2) для центробежной силы в (7), получим:

m( 1- /₀ ) ² x = fv. (8)

Отсюда масса макромолекул запишется так:

m = ( 1/ (1- /₀ ) (v/²x). (9)

Вводится новая важная характеристика – коэффициент седиментации s - отношение скорости седиментации v к угловому ускорению ²x:

s = v/²x = dx/dt  1/² x = 1/²  d(ln x)/dt. (10)

Размерность коэффициента седиментации – [с]. За единицу седиментации принят 1 (С) – 10^-13с.

Вводится парциальный удельный объем:

= [ л/кг ]. (11)

Он определяется как возрастание объема растворителя при растворении 1 кг сухого вещества в фиксированном объеме растворителя. Если подставить  и заменить f через коэффициент диффузии D , получим массу макромолекулы:

m = k₀ Ts / D (1- ₀  ). (12)

Молекулярная масса макромолекулы запишется как:

M = RTs / D (1- ₀  ). (13)

Р ис.1. Седиментация макромолекул в кювете: а - положение границы седиментации в кювете; (время седиментации t₀ ,t₁ ,t₂,t₃ ); б - изменение концентрации с макромолекул вдоль кюветы; в – перемещение шлирен- пика при седиментации макромолекул.

Рис. 2. Действие сил на макромолекулу при центрифугировании:

00-ось вращения ротора.

Это- формула Сведберга. Для определения молекулярной массы необходимо измерить на центрифуге s , определить заранее D и знать   Требуется высокая точность измерения , так как для биологических макромолекул он изменяется в небольших пределах (от 0,6 до 0,75). Ошибка при его измерении в 1% дает ошибку в определении до 3% .

Измеряют плотность раствора пикнометрическим способом (взвешивание фиксированных V объемов растворителя и раствора). В пикнометр заливаются одинаковые объемы растворителя и раствора макромолекул с известной концентрацией с. Затем эти пробирки точно взвешиваются и определяются плотности растворителя ₀ = m₀ /V и раствора p = m/V. Парциальный объем находят по формуле:

 = 1/ – (1/c)  (( -₀ ) / ). (14)

Необходимо иметь в виду следующее: для определения молекулярной массы по формуле Сведберга (13) необходимо определять s и D в одинаковых растворителях, при одинаковых температурах, экстраполируя полученные значения к бесконечному разбавлению. Определяют константу седиментации S⁰_20, . Для этого в полученное значение s вносят поправки на плотность ₀ и вязкость :

S⁰_20, = s ( /_20, )  (1- ₀  )_20,w / (1- ₀  ). (15)

В Таблице приведены значения S⁰_20, и  для ряда белков и полученные по ним молекулярные массы.

Таблица 1

Некоторые физические параметры белков: константа седиментации S⁰_{20, ,} коэффициент диффузии D⁰_{20, ,} парциальный удельный объём  и молекулярная масса М

D⁰_20,  10¹¹,

Белок S⁰_20, 

10¹³,c m³  c^-1 , л  кг ^-1 М

Цитохром 0₁ 1,71 11,40 0,728 13370

Лизоцим 1,91 11,20 0,703 13930

Рибонуклеаза 2,00 13,10 0,707 12640

Моглобин 2,04 11,3 0,74 16890

Сывороточный альбумин 4,60 6,10 0,733 68460

человека (САЧ)

Каталаза печени 11,2 4,10 0,735 250000

Уреаза 18,6 3,46 0,73 480000

Гемоцианин 98,9 1,38 0,738 6,6*10⁶