2)Мікроелектроди

3)Застосування методів

• Аналіз електричних явищ в клітинній мембрані;

• Аналіз іонних струмів через канали;

• Аналіз часових характеристик струму;

• Аналіз мембранної ємності;

• Аналіз транслокації обмінників та транспотерів.

Іони “протікають” через прості канали

4)Функціональна класифікація іонних каналів

РОДИНА ЛІГАНД-КОНТРОЛЬОВАНИХ ІОННИХ КАНАЛІВ

АТФ-контрольовані канали

Р2Х рецептори (7 ізоформ) складаються з 3 гомологічних субодиниць

Глутамат-активовані катіонні канали

NMDA- та AMPA-рецептори, каїнатні рецептори складаються з 4 субодиниць

Родина Цис-петлі

Нікотиновий та гліциновий рецептори, деякі глутамат-активовані іонні канали, ГАМКА та ГАМКС рецептори, складаються з 5 субодиниць

Розрізняють два види цих каналів – в залежності від розташування ділянки зв'язування ліганду:

• Зовнішньоклітинна ділянка;

• Внутрішньоклітинна ділянка

РОДИНА ПОТЕНЦІАЛЗАЛЕЖНИХ ІОННИХ КАНАЛІВ

Складаються з 4 доменів

• Na+ & Ca2+ канали: простий поліпептидний ланцюг (переважно -субодиниць);

• K+ канал: тетрамер з 4 ідентичних α-субодиниць +β –всередині пори;

Кожен домен складається з 6 трансмембранних сегментів

Р-петля (пора) сформована з S5-S6 – іонна селективність;

Кожен домен складається з 6 трансмембранних сегментів

Р-петля (пора) сформована з S5-S6 – іонна селективність;

S1-S3 - менш упаковані

субодиниці;

S4 – формує електричний сенсор;

S4-S6 – щільно упаковані

сегменти, відіграють важливу

роль у формуванні іон-селективної

пори та ворітних механізмах.

S4 послідовність

• Включає заряджені амінокислоти (Lys or Arg);

• Сенсор напруги – регулює відкривання іонної пори;

Ідентифіковані у бактерій, про- та еукаріот.

У клітинах серцевого та скелетного м'язів, нервових клітинах

ФУНКЦІОНАЛЬНІ ДОМЕНИ

• Іонселективний фільтр;

• Сенсор електричної напруги – містить позитивно заряджені залишки амінокислот, котрі реагують на зміну мембранного потенціалу;

• Інактиваційні ворота – відкриває/закриває іонний канал, котролюється сенсором.

Механічний натяг мембрани індукує конформаційні зміни у білків каналів.

Це у свою чергу змінює проникність іонних каналів для іонів.

РОДИНА БЕЗВОРІТНИХ ІОННИХ КАНАЛІВ

Плазматична мембрана містить значно більше К+ NON-GATED іонних каналів, ніж Nа+ NON-GATED іонних каналів – така мембрана володіє високою калієвою проникністю.

5)Потенціалзалежні Nа+-канали

Найповнішу інформацію про властивості потенціалкерованих Na+-каналів отримано в дослідженнях на гігантському аксоні кальмара та перехватах Ранв”є

У. Чанлер і Х. Мевес виміряли проникність Na+-каналів аксона кальмара для іонів лужних металів (ряд Ейзенмана):

Li+ > Na+ > K+ > Rb+ > Cs+

1,1 : 1,0 : 0,083 : 0,025 : 0,016

Іони амонію також можуть бути носіями струму через Na+- канал.

Для опису функціонування натрієвого каналу використовують модель Хілла для створення структури селективного фільтра Na+-каналу.

Відносну проникність розраховують згідно теорії постійного поля Гольдмана-Ходжкіна:

де Еr, s– потенціал реверсії для струму, що тече по натрієвих каналах у безнатрієвому розчині за присутності іонів Ѕ+;

Еr, Na – потенціал реверсії для натрієвого струму;

РNa і РЅ – проникність мембран для іонів.

Хілле встановив послідовність вибірковості натрієвих каналів для органічних катіонів:

Натрій > гідроксиламін > гідразин > амоній = гуанідин = гідроксигуанідин > аміногуанідин

Відповідно до моделі Хілла вхід у Na+-канал має форму прямокутника, розмір якого становить приблизно 0,5 на 0,3 нм. Це мінімальний розмір, який необхідний для того, щоб проникні через канал органічні катіони, утворюючи водневі зв'язки з атомами кисню (8), як і належать карбонільним та карбоксильним групам білка могли подолати фільтр та пройти через канал.

Тому метильна група не може утворювати водневі зв'язки.

БУДОВА Na+-КАНАЛІВ

З допомогою хроматографічного методу виділено та очищено Na+-канали електричного органу вугра, мозку та скелетних м'язів ссавців. Ці дослідження дали змогу ідентифікувати глікопротеїн (260 кДа) як головний компонент Na+-каналу (α-субодиниця, вугор). Однак для інших об'єктів характерні β-субодиниці (33 (β2) та 36 (β1) кДа

α-субодиниця – трансмембранний білок, містить локуси зв'язування токсинів та фосфорилювання, він формує канал. β1 і β2-субодиниці є інтегральними глікозильованими білками, 1 – нековалентно асоційована з α-субодиницею, а 2 з'єднана з нею дисульфідним зв'язком.

ТОКСИНИ-МОДУЛЯТОРИ Na+-КАНАЛІВ

БЛОКАТОРИ.

Потенціалзалежні Na+-канали є мішенями для дії низки природних та синтетичних токсинів. Ідентифіковано приблизно 6 спеціалізованих рецепторів, котрі взаємодіють з токсинами.

Існує 2 види блокування Na+-каналів:

• зв'язування безпосередньо в порі каналу, що блокує проходження іона через канал;

• алостеричне зв'язування агента макромолекулярними структурами рецептора на зовнішній поверхні мембрани

Існує 2 класи ТОКСИНІВ-МОДУЛЯТОРІВ Na+-каналів:

• розчинні в ліпідах стероїди, такі як рослинні алкалоїди вератридин та аконітин, отрута батрахотоксин (секрет залоз південноамериканської жаби Phyllobates) – забезпечують стійку активацію натрієвих каналів навіть за ПС, завдяки зміщенню потенціалзалежності активації каналів у напрямку більш негативних значень МП; ліпофільна природа токсинів зумовлює їхню дію як при зовнішньо- так і внутрішньоклітинному застосуванні.

• пептидні токсини отрути скорпіонів (харібдотоксин) і анемон – вибірково конкурентно взаємодіють з рецептом, розташованим біля зовнішнього входу в Na+-канал.

ПАЛІТОКСИН

Токсичність:

• Механізм дії – не повязаний з іонними каналами, а блокує трансформацію Na+,К+-помпи в канал.

ТОКСИНИ-МОДУЛЯТОРИ Na+-КАНАЛІВ

Такі токсини збільшують тривалість ПД нервових волокон у сотні разів унаслідок уповільнення інактивації Na+-каналів – α-токсинами.

В отруті скорпіонів містяться токсини, що впливають на механізми активації Na+-каналів – (β-токсини) – канали залишаються відкритими впродовж сотень мілісекунд після повернення МП до рівня ПС.

БЛОКАТОРИ Na+-каналів відіграють важливу роль в ідентифікації каналів та іонних струмів.

До таких речовин належить тетродотоксин та сакситоксин, які зв'язуються з центральним локусом, розташованим у зовнішньому вході Na+-каналу і блокується провідність внаслідок оклюзії пори.

САКСИТОКСИН

Токсичність:

• Сакситоксин міститься у джгутикових (Gonyaulax);

• Механізм дії – зв'язується з потенціалзалежними Na+-каналами і блокує Na+- струм.

Клініка:

• Швидка відповідь;

• Оніміння губ, язика, кінцівок;

• Легенева недостатність, серцева аритмія;

• Летальність – кома;

• Відновлення 4/5 днів;

ТЕТРОДОТОКСИН

Тетродотоксин мітиться в яєчниках та печінці, шкірі риб Tetradontidae й тритонів Taricha torosa, діючи на зовнішню поверхню мембрани й блокує виникнення ПД у нервах та скелетних м'язів.

Токсичність:

• Тетродотоксин концентрується в шкірі, гонадах, печінці;

• Механізм дії – зв'язується з потенціалзалежними Na+-каналами і блокує Na+- струм.

Клініка:

• Відповідь від 15 хв до 12 год;

• Оніміння губ, язика, кінцівок;

• Легенева недостатність, серцева аритмія;

• Летальність – кома;

• Відновлення 4/5 днів;

ГОНОТОКСИН

Токсичність:

• Na+-канали , N-, P- & Q-type Сa2+-каналами.

МІСЦЕВІ АНАСТЕТИКИ

Модифікуюча дія місцевих анестетиків на Na+-канали:

• Вони зв'язуються з гідрофобним локусом рецептора канального білка, і забезпечують інактивацію.

• Місцеві анестетики (третинні аміни) використовують в клініці, оскільки механізм полягає у протонування аміногрупи і переходу молекули в заряджений стан.

ЛІДОКАЇН

• Механізм дії – дозозалежно зв'язується з потенціалзалежними Na+-каналами і блокує Na+- струм;

• Блокує тільки відкриті канали;

• У високій дозі блокує провідність мембрани;

• У дуже високій дозі блокує також і потенціалзалежні К+-канал.

6)Потенціалзалежні Са2+-канали

Надходження іонів кальцію у клітину відбувається за допомогою Са2+-каналів.

Розрізняють 2 класи цих каналів :

• Потенціалзалежні (контролюються зміною потенціалу); виявлено у ПМ всіх збудливих клітин, зокрема, серцевого, гладкого та скелетногго мязів, ендокринних клітинах, нервових клітинах.

• Рецепторкеровані (контролюються мембранними рецепторами, які взаємодіють переважно з нейромедіаторами).

Найповнішу інформацію про спроможність двовалентних катіонів переносити вхідний струм в м'язових волокнах ракоподібних отримано С. Хагіварою на м'язах морського жолудя Balanus nubilis.

Згідно розрахунків підвищення концентрації іонів кальцію, узгоджується з розрахунком кальцієвого рівноважного потенціалу за формулою Нернста:

де ЕCa– рівноважний потенціал для іонів кальцію;

С. Хагівара та К. Такахаші припустили, що важливим проміжним етапом у механізмі проникнення іонів кальцію через мембрану є їх звязування з певною структурою Са2+-каналу, що схематично можна зобразити так:

де Х– місце зв'язування кальцію;

Са2+о, Са2+і – іони кальцію, що перебувають поза й усередині клітини.

П ідвищення концентрації іонів кальцію у зовнішньому середовищі зумовлює збільшення вхідного кальцієвого струму:

Через Са2+-канал легко проходять та генерують струм інші двовалентні катіони

Са2+ > Sr2+ > Ba2+

1,0 : 1,05 :1,13

КЛАСИФІКАЦІЯ Сa2+-КАНАЛІВ

С.Хагівара (1975) з співробітниками зареєстрували різні кальцієві струми на яйцеклітинах морської зірки. Подальші дослідження на нейронах проведені С. Федулою й П.Г. Костюком (1983), Е. Карбоне та Г. Люксом (1984) показали, що потенціалзалежні Са2+-канали :

• низькопорогові (належить Т-тип, які швидко інактивуються);

• високопорогові (розрізняють L (скелетні, серцеві м'язи, нервові клітини), N, P, Q, R –типи котрі володіють високою специфічністю до певних блокаторів та токсинів.

БУДОВА Сa2+-КАНАЛІВ

Головна субодиниця α1 є структурним аналогом α-субодиниці Na+-каналу.

Са2+-канали в нервових клітинах асоційовані з α2 та δ-субодиницями, які формують зв'язаний дисульфідом трансмембранний глікопротеїновий комплекс, а β-субодиниця є внутрішньоклітинною частиною каналу.

Са2+-канали скелетних м'язів мають трансмембранну γ-субодиницю.

Існує значна кількість органічних блокаторів кальцієвих каналів, які широко використовуються в клініці як антиаритмічні й судинорозширювальні засоби. Найбільш поширеними блокаторами є фенілалкаламін (верапаміл і його похідне Д-600 – зв'язується з S6 сегментом), дильтіазем і ніфедипін

Сa2+-КАНАЛИ та НЕОРГАНІЧНІ ІОНИ

С.Хагівара та К. Такахаші встановили, що двовалентні іони, а також іони La3+ пригнічують струми які течуть по Са2+-каналах. В основі такої дії лежить конкурентне звязування Са2+-каналу з цими іонами. Іони Cd2+, Mn2+, Co2+, Ni2+ використовують як специфічні блокатори Т-типу Са2+-каналів.

Вивчаючи властивості Са2+-каналів нейронів молюсків П. Костюк та О. Кришталь виявили, що у безкальцієвому розчині за присутності ЕГТА або ЕДТА відбувається модифікація цих каналів.

Регуляція високопорогових Са2+-каналів фосфорилюванням та вторинними посередниками.

Встановлено що адреналін та норадреналін в міокарді ссавців та амфібій підсилюють кальцієвий струм, взаємодіючи з β-адренорецепторами (метаботропні рецептори). Ефект опосередковано ГТФ-зв'язувальним Gs-білком, що активує аденілатциклазу, що призводить до внутрішньоклітинного підвищення цАМФ.

Активація рецепторів нейромедіаторів модулює активність Са2+-каналів за допомогою фосфорилювання через протеїнкінази А та С.

7) Властивості та будова К+-каналів

К+-канали – це велика група макромолекул, що формують пори, які переважно є проникними для К+.

При вивченні вибірковості К+-каналів у перехватах Ранв”є мієлінізованих нервових волокон жаби для одновалентних катіонів Хілле встановив таку послідовність проникності :

Tl+ > K+ > Rb+ > NH4+

2,3 : 1,0 : 0,92 : 0,13

Провідність К+-каналів, як і натрієвих, блокується за зниження рН зовнішнього розчину, внаслідок протонування кислотної групи, що перебуває в каналі.

БУДОВА К+-КАНАЛІВ

На підставі іонної вибірковості зроблено пипущення, що діаметр (селективний фільтр – на рисунку зліва – чорний) вузької частини К+-каналу дорівнює 0,3 нм і вона є проникною для іонів з кристалічним діаметром від 0,26 нм (К+) до 0,296 нм (Rb+, NH4+).

Через неї не можуть пройти як більші іони (Cs+-0,33 нм, TEA - 0,8 нм) так і менші (Na+- 0,19 нм, Li+ - 0,14 нм).

Це пов'язано з тим, що іон який проходить через пору повинен втратити гідратну оболонку, а це можливо тоді коли дегідратований іон взаємодіяти з стінками пори, де розміщені 5 атомів кисню, що належать карбонільним групам.

Білок сладається з однієї послідовності S1-S6 - це складні гетероолігомерні білки, утворені 4 α-субодиницями, що формують головну частину каналу та допоміжними β-субодиницями, які прилягають до цитоплазматичної поверхні α-субодиниці і модифікують ворітні процеси.

При клонуванні α-субодиниці потенціалзалежного К+-каналу встановлено, що на кількість аміноксилот припадає приблизно одна четверть їхньої кількості у Na+-каналу.

К+-канали витоку (KCNK) сформовані з двох Р-доменів і 4 трансмембранних сегментів, пора каналу сформована двома мономерами, регулюють функціонування гангліїв вісцеральної системи, міокардіоцитів.

К+-канали вхідного випрямлення (Kir);

АТФ-чутливі К+-канали (КАТР-канали)

КЛАСИФІКАЦІЯ К+-КАНАЛІВ

На нейронах молюсків вперше ідентифіковано “швидкі” потенціалзалежні К+-канали або А-канали (С. Хагівара, 1961; Ч. Стівенс, 1971).

У багатьох типах клітин збільшення концентрації іонізованого кальцію в цитоплазмі призводить до активації калієвої провідності, цей феномен виявлено Дж. Гардосом (1958) на еритроцитах і зумовлений Са2+-активованими К+-каналами (КСа-канали):

• великі КСа-канали виявлено у клітинах гладеньких м'язів, нервових вузлів, хромафінних клітинах, вони активуються деполяризацією мембрани, блокуються токсинами які містяться в отруті скорпіонів;

• малі КСа-канали виявлено у мембрані еритроцитів, в ацинарних клітинах підшлункової залози, у соматичній мембрані нейронів молюсків, провідність їх не перевищує 50 пСм, отрута бджоли апамін блокує ці канали, вони можуть бути як потенціалзалежними так і потенціалнезалежними;

Блокатори К+-каналів????????????