18-2.1-укр — протокол

Тема заняття № 1. Тестовий контроль початкового рівня знань. Вивчення принципів проведення біохімічних лабораторних досліджень. Дослідження фізико-хімічних властивостей білків.

Конкретні цілі:

• Аналізувати етапи та закономірності становлення біохімії як фундаментальної медико-біологічної науки та навчальної дисципліни;

• Пояснювати принципи і методи біохімічних досліджень функціонального стану організму людини в нормі і при патології;

• Використовувати результати біохімічного аналізу для оцінки стану певних етапів обміну речовин

• Класифікувати результати біохімічних досліджень та зміни біохімічних показників для діагностики патологічних процесів.

• На основі розуміння фізико-хімічних властивостей білків-ферментів пояснювати залежність активності ферментів від рН середовища, температури та інших факторів.

• Аналізувати методи виявлення активності ферментів з метою їх оптимального застосування в клініко-лабораторному аналізі.

Теоретичні питання

1. Біохімія як фундаментальна медико-біологічна наука (історія розвитку; наукові біохімічні школи, значення в системі вищої медичної освіти).

2. Розділи біохімії (статична, динамічна, функціональна біохімія; медична та клінічна біохімія).

3. Досягнення біохімії, молекулярної біології, біотехнології та генної інженерії у встановленні молекулярних механізмів патогенезу захворювань, діагностиці та лікуванні основних захворювань людини: серцево-судинних, онкологічних, інфекційних, тощо.

4. Мета проведення біохімічних лабораторних досліджень. Критерії оцінки використаних методів лабораторних досліджень.

5. Матеріал для лабораторних діагностичних досліджень (принципи забору та зберігання матеріалу для лабораторних досліджень; помилки при проведенні лабораторних досліджень).

6. Основні методи біохімічних досліджень (осадження речовин з розчину, висолювання білків; спектрофотометрія; електрофорез, хроматографія, полярографія).

7. Функції білків в організмі (каталітична, структурна, регуляторна, рецепторна, транспортна, скорочувальна, захисна).

8. Фізико-хімічні властивості білків-ферментів: електрохімічні (поверхневий заряд молекули) властивості, розчинність, термодинамічна стабільність білкових молекул-ферментів, осадження, денатурація, взаємодія з лігандами та її функціональне значення.

9. Ферменти як біологічні каталізатори реакцій обміну речовин.

10. Властивості ферментів:

• залежність активності ферментів від рН середовища;

• залежність активності ферментів від температури.

11. Методи виявлення ферментів в біологічних об’єктах (кров, слина, сеча, окремі тканини).

Практична робота

Завдання 1. Визначення наявності речовини в розчині методом осадження (на прикладі осадження білків з розчину сульфосалициловою кислотою).

Принцип методу. Білки легко осаджуються з водного розчину мінеральними, органічними кислотами і солями важких металів. Денатурація і осадження білків кислотами обумовлені нейтралізацією поверхневого заряду колоїдних частинок білка, руйнуванням гідратаційної оболонки білкових молекул і утворенням комплексних солей білка з кислотами. Важкі метали утворюють стійкі комплекси з SH-групами білків, що викликає зміни структури і розчинності білка. Особливо чутливими реакціями на наявність білка в розчині є осадження трихлороцтовою і сульфосалициловою кислотами (чутливість останньої реакції складає 1: 50000). Крім того, сульфосаліцилова кислота, поряд з високомолекулярними білками, здатна осаджувати низькомолекулярні білки і продукти розпаду білків - поліпептиди і олігопептиди.

Хід роботи. У пробірку наливають 1,0 мл досліджуваного розчину білка і додають 3-5 крапель 20% розчину сульфосаліцилової кислоти. Спостерігають утворення осаду білка.

Клініко-діагностичне та практичне значення. Реакції з сульфосалициловою і трихлороцтовою кислотами використовуються для якісного та кількісного визначення білка в сечі.

Здатність білка міцно зв'язувати іони важких металів використовується в клінічній практиці. Білок використовують як протиотруту при отруєннях солями ртуті, свинцю, тощо. При отруєнні солями важких металів хворому дають велику кількість білка (яєчного білка або молока). У шлунку утворюються нерозчинні комплекси металів з білками, внаслідок чого припиняється всмоктування отрут і їх надходження в кров, зменшується інтоксикація і посилюється їх виведення з організму.

Завдання 2. Визначення наявності речовини в розчині за специфічною кольоровою реакцією; на прикладі біуретової реакції визначення пептидного зв'язку в розчині білка після часткового гідролізу (1, 6, 12 годин).

Принцип методу. Біуретова реакція - характерна реакція для сполук, що містять у своєму складі не менше двох пептидних зв'язків. Такі сполуки в лужному середовищі утворюють з мідним купоросом комплекс рожево-фіолетового кольору. В утворенні цього комплексу беруть участь пептидні зв'язки в енольній формі.

Біуретова реакція служить доказом наявності пептидних зв'язків в білках і пептидах.

Хід роботи. У пробірку № 1 вносять 1мл досліджуваного розчину білка, у пробірку № 2 - 1мл гідролізату білка (1год.), у пробірку № 3 - 1мл гідролізату білка (6год.), у пробірку № 4 - 1 мл гідролізату білка ( 12год.). У кожну пробірку додають по 5 крапель 10% розчину NaOH і по 5 крапель 1% розчину сульфату міді (CuSO₄). Поява фіолетового забарвлення (біуретова реакція) свідчить про наявність в розчині білка або поліпептидів. Інтенсивність забарвлення змінюється в залежності від часу гідролізу.

На підставі проведеного експерименту зробити висновки виходячи зі змін інтенсивності забарвлення.

Українська й англійська термінологія заняття

Ферменти (ензими) – каталізатори білкової природи, що синтезуються в клітинах живих організмів та забезпечують перебіг біохімічних реакцій.	Enzymes are catalysts of protein nature, which are synthesized in cells of living organisms and provide the course of biochemical reactions.
Властивості ферментів: підвищують швидкість перебігу біохімічних реакцій, що відповідають законам термодинаміки; підвищують швидкість перебігу як прямої так і зворотної реакції не змінюючи константу рівноваги; протягом реакції фермент вступає у взаємодію із субстратом, але не входить до складу продуктів реакції; ферменти є високо специфічними каталізаторами; ферменти чутливі до змін фізико-хімічних умов середовища (t^0, pH); на активність ферментів впливають певні хімічні сполуки – активатори та інгібітори.	Properties of enzymes: - increase the rate of biochemical reactions corresponding to the laws of thermodynamics; - increase the velocity of both direct and reciprocal reactions without changing the equilibrium constant; - during the reaction, the enzyme interacts with the substrate, but it is not the part of the reaction products; - Enzymes are highly specific catalysts; - enzymes are sensitive to changes in physical and chemical conditions of the environment (t^0, pH); - the activity of enzymes is influenced by certain chemical compounds - activators and inhibitors.
Методи виділення і дослідження біологічного матеріалу: 1. Висолювання – осадження білків із досліджуваних розчинів дією солей лужних і лужноземельних металів. 2. Хроматографія – метод, що базується на розподілі речовин між рухомою і нерухомою фазами. Є кілька видів хроматографії: Адсорбційна хроматографія ґрунтується на відносній спорідненості досліджуваних речовин до твердих адсорбентів; Розподільча хроматографія основана на розподілі речовин між двома рідкими фазами або між рідкою і газовою фазами; Іонообмінна хроматографія полягає в хімічній взаємодії активних груп нерухомої фази з іонами досліджуваної суміші; Гель-хроматографія (гель-фільтрація) базується на різниці в розмірах і масі молекул; 3. Електрофорез – метод розділення сумішей речовин під дією електричного струму. 4. Ультрацентрифугування (седиментаційний аналіз) – осадження макромолекул під дією відцентрового прискорення. 5. Мас-спектроскопія – метод дослідження хімічної структури досліджуваної речовини, заснований на іонізації молекул для отримання індивідуального спектру речовини. 6. Ядерний магнітний резонанс – метод дослідження хімічної структури досліджуваної речовини, заснований на здатності атомних ядер поглинати електромагнітне випромінювання у зовнішньому магнітному полі.	Methods of isolation and biological material investigation: 1. Salting out - deposition of proteins from the investigated solutions by the action of salts alkaline and alkaline earth metals. 2. Chromatography - a method, which are based on the distribution of substances between movable and stationary phases. There are several types of chromatography: - Adsorption chromatography is based on the relative affinity of the investigated substances to solid adsorbents; - Distribution chromatography is based on the distribution of substances between two liquid phases or between the liquid and gas phases; - Ion exchange chromatography it is about the chemical interaction between the active groups of the fixed phase and the ions of the investigation mixture; - Gel chromatography (gel filtration) is based on the difference between the molecules size and mass; 3. Electrophoresis - a method of separating substances mixtures under the action of electric current. 4. Ultracentrifugation (sedimentation analysis) - precipitation of macromolecules under the action of centrifugal acceleration. 5. Mass spectroscopy - a method of investigating the chemical structure of the testing substance, based on molecules ionization and obtaining an individual spectrum of a substance. 6. Nuclear magnetic resonance - a method of investigating the chemical structure of the testing substance, based on the ability of atomic nuclei to absorb electromagnetic radiation in an external magnetic field.

Рекомендована література.

Основна:

1. Губський Ю.І. Біологічна хімія. – Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. - 508 с.

2. Хмелевский Ю.В. Биологическая химия: Практикум. – К.: Вища школа., 1985. – 207 с.

3. Обмін речовин та його показники. Методичні розробки практичних занять з біологічної хімії. Під ред. Ю.В. Хмелевського. – Київ: НМУ. – 1992. – 37 с.

Додаткова:

1. Маршалл В.Д. Клиническая биохимия. – М.: Бином-Диалект, 2011. – 408 с.

2. Ленинджер А. Основы биохимии: В 3 т.- М.: Мир, 1985.- 1056 с.

3. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека: В 2 т. - М.: Мир, 1993. - т.1 - 381 с.; т.2 - 414 с.