ГЕНЫ И ГЕНОМЫ

GENES & GENOMES

A changing Perspective

Maxine Singer

President, Carnegie Institution of

Washington Scientist Emeritus,

National Institutes of Health

Paul Berg

Willson Professor of Biochemistry

Director, Beckman Center for Molecular

and Genetic Medicine,

Stanford University School of Medicine

University Science Books

MillValley,California

М.СИНГЕР, П.БЕРГ

В двух томах

Том 1

Перевод с английского д-ра биол. наук Т.С. Ильиной

д-ра биол. наук Ю.М. Романовой

под редакцией д-ра биол. наук Н.К. Янковского

МОСКВА «МИР» 1998

УДК 575.113/118 ББК 28.04

С38

Авторы: Сингер М., Берг П.

С38 Гены и геномы: В 2-х т. Т. 1. Пер. с англ. М.: Мир, 1998.– 373 с., ил.

ISBN 5-03-002849-8

Университетское руководство по молекулярной биологии, написанное выдающимися американскими учеными, членами Национальной академии наук (П. Берг - лауреат Нобелевской премии). Книгу отличают общебиологический подход, глубина теоретических обобщений, изящная и наглядная форма подачи материала.

В 1-м томе рассматриваются следующие вопросы: строение и функционирование биологических молекул, участвующих в работе генетического аппарата; процессы репликации и экспрессии генов; широкий круг вопросов, относящихся к технологии рекомбинантных ДНК (ферментные системы, системы вектор–хозяин, манипуляции с рекомбинантными ДНК).

Для молекулярных биологов, преподавателей и студентов университетов, специалистов.

ББК 28.04

Редакция литературы по биологии

Издание осуществлено при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований по проекту № 98-04-62107

ISBN	5-03-002848-Х (русск.)	©	1991 by University Science Books
ISBN	5-03-002849-8	©	перевод на русский язык издательство
ISBN 0-935702-17-2 (англ.)			«Мир», 1998

ОТ РЕДАКТОРА ПЕРЕВОДА

Книга «Гены и геномы» отличается сочетанием		обсуждаются принципы функционирования и пер-
традиционных разделов	молекулярной генетики,	спективы дальнейших исследований сложных био-
таких, как молекулярные основы наследственности,		логических систем (мультигенные семейства, ткане-
технология рекомбинантных ДНК, анатомия, экс-		специфичная экспрессия, эмбриональное	развитие
прессия и регуляция генов, с новым взглядом на		и дифференцировка).
молекулярно-генетические	проблемы – рассмотре-	Каждой части предшествует краткий обзор об-
нием их в контексте организации и функциониро-		щих принципов и концепций рассматриваемых в
вания целых геномов.		этом разделе вопросов молекулярной генетики; за
Авторы книги М. Сингер и лауреат Нобелевской		ним следует углубленное описание эксперименталь-
премии по химии П. Берг–всемирно известные спе-		ных работ, на основе которых эти концепции были
циалисты в области молекулярной биологии, одни		сформулированы. Завершаются части списком пер-
из создателей генной инженерии, методической ос-		воисточников по ключевым экспериментальным ра-
новы современной молекулярной биологии и гене-		ботам данного направления.
тики. Читатель найдет в книге подробные сведения		Книга может служить руководством для под-
о структуре и функциях ДНК, РНК, белков; репли-		готовки студентов и аспирантов на биологических
кации и функционировании генома, обратной транс-		и медицинских факультетах вузов, а также поможет
крипции; модификациях, репарации и рекомбинации		научным работникам ориентироваться в новых об-
ДНК; о транскрипции и трансляции мРНК в клетках		ластях исследования, связанных с изучением гено-
про- и эукариот; регуляции экспрессии генов; техно-		мов. Понимание текста облегчают многочисленные
логии рекомбинантных ДНК. Все эти вопросы об-		оригинальные иллюстрации и таблицы. Они будут
суждаются в первых двух частях книги.		также полезны преподавателям вузов в качестве
Особый интерес для нашего читателя представ-		иллюстративного материала при чтении лекций.
ляет описание молекулярной анатомии эукариоти-		Издание русского перевода книги «Гены и ге-
ческих геномов, интегрирующее современные мо-		номы» особенно своевременно, поскольку развитие
лекулярно-биологические знания в данной области		современной молекулярной биологии идет во мно-
(часть III), поскольку в отечественной литературе		гом через исследования структуры и функций гено-
информация по этим проблемам носит фрагмен-		мов, проводимые в рамках всемирной программы
тарный характер. Авторы анализируют структуру		«Геном человека».
и функции генома как целого и роль геномных		Книгу переводили: Т.С. Ильина (введение к ч. II,
перестроек в функционировании генома в норме и		гл. 4–7), Е.А. Кабанова (введение к ч. III, гл. 8),
патологии, подчиняя этой задаче рассмотрение его		А.А. Лушникова (гл. 9, 10, ч. III), Ю.М. Романова
элементов (тандемных и диспергированных повто-		(предисловие, благодарности, введение к ч. I, гл. 1–3).
ров, центромерных и теломерных областей, транс-
позонов и др.). В заключительной, четвертой части		Н.К.	Янковский

ПРЕДИСЛОВИЕ

Эта книга посвящена молекулярным структурам	сосредоточив внимание на тех проблемах, которые
и механизмам, лежащим в основе передачи и	уже довольно глубоко изучены и наглядно иллюст-
использования генетической информации сложными	рируют достигнутый прогресс.
организмами. Представляя ее, мы надеемся, что	Наша главная задача состояла в том, чтобы
у читателя возникнет чувство предвкушения того	раскрыть сущность и глубину экспериментальных
удовольствия, которое он получит, знакомясь с	подходов науки, которая была названа молекуляр-
открытиями в области рекомбинантных ДНК.	ной генетикой, применительно к эукариотическим
Чтобы подготовить читателя к восприятию этих	организмам. Чтобы решить эту задачу, а также
новейших достижений, мы остановились во введе-	облегчить понимание материала читателями, об-
нии к гл. 1–3 на классических генетических и био-	ладающими ограниченным объемом знаний по
химических исследованиях, проведенных в период	биохимии, клеточной биологии и генетике, мы по-
с начала века до примерно 1972 г. Эти исследования	старались изложить основы этих направлений био-
были выполнены преимущественно на микроорга-	логии двумя способами. Во-первых, в гл. 1, 2 и 3
низмах, и благодаря им удалось установить струк-	суммирована наиболее важная информация о струк-
туру и функции генов и геномов. Разработка в на-	туре ДНК, РНК и белков; о различных клеточных
чале 70-х годов методов получения рекомбинантных	процессах, протекающих с участием ДНК (репли-
ДНК и связанный с этим прогресс в технологии	кация, репарация и рекомбинация); об основных
быстрого определения нуклеотидной последова-	механизмах транскрипции, трансляции и контроле
тельности ДНК позволили вскоре применить моле-	экспрессии генов. Читатели, хорошо ориентирую-
кулярные методы и для исследования более слож-	щиеся в данных вопросах, могут пропустить эти
ных геномов. Ядро книги составляют работы,	главы. Во-вторых, во введениях к частям I, II и III
выполненные менее чем за два десятилетия, которые	даны исторические экскурсы и общий взгляд на
показали, какие широкие возможности дает исполь-	проблемы, изложенные в главах, составляющих эти
зование этих методов в биологии.	части. В них не говорится детально о том, как были
Книга создавалась довольно долго. Идея ее на-	открыты и доказаны те или иные положения, а де-
писания возникла после того, как один из нас (П. Б.)	лается попытка объяснить, как на основе различных
прочел серию публичных лекций в университете	исследований в области биохимии, генетики, мик-
Питтсбурга в 1979 г. Попытка подготовить публи-	робиологии, клеточной и эволюционной биологии
кацию лекций показала несостоятельность этого	был выстроен интеллектуальный каркас совре-
замысла. Когда такие лекции читаются в аудитории	менной биологии. Так, во введении, предваряю-
слушателей, не являющихся биологами, приходится	щем гл. 1, 2 и 3, прослеживается исторический путь,
опускать многие интересные детали, и книга, ли-	приведший нас к современному взгляду на на-
шенная таких тонкостей, конечно, не может при-	следственность. Мы знакомимся с концепцией гена,
нести удовлетворения. По мере расширения кон-	трансмиссией и сегрегацией генов, с логическим
цептуальной основы книги становилась очевидной	переходом от первичного картирования генетиче-
необходимось разделить тяжкий труд по ее напи-	ских детерминант к точной локализации генов на
санию с кем-нибудь еще. Так нас стало двое. Мы	хромосоме, с идентификацией генов как дискретных
вместе прорабатывали весь материал, пытаясь до-	участков молекулы дезоксирибонуклеиновой кис-
биться унифицированного, согласованного подхода	лоты и	информационными взаимоотношениями
и стиля. Мы поняли всю безрассудность попытки	между ДНК, РНК и белками.
дать всестороннее, всеобъемлющее изложение ма-	В части II (гл. 4–7) описаны подходы к конст-
териала; эта задача была успешно решена до нас	руированию рекомбинантных молекул ДНК, их
большими группами авторов в нескольких недавних	клонированию, отбору и характеристике, а также
блестящих изданиях. Нам приходилось постоянно	другие экспериментальные методы, использую-
пересматривать уже написанные главы, чтобы их	щиеся в молекулярной генетике. Основное внимание
окончательный вариант соответствовал последую-	уделяется принципам этих методов, а не лабора-
щим разделам, еще находящимся в работе. Чтобы	торным приемам. Читатели, которых больше ин-
нас не захлестнул поток постоянно поступающей	тересуют	методические детали, могут обратиться
новой информации, мы ограничили наши задачи,	к замечательным сборникам, вышедшим за послед-

ПРЕДИСЛОВИЕ

7

ние 10 лет; ссылки на них даны в книге. Во введении,

гическим системам. Показано, что гены рабо-

предваряющем

гл.

4–7, особое

внимание уде-

тают в составе сложных многокомпонентных

ляется

истории

развития

современных

подходов

взаимодействующих систем. В каждой из таких

и методов, разработанных на основе огромного

систем

указанные

общие

принципы

используются

количества казалось бы не связанных между собой

по-своему, что приводит к огромному разно-

фундаментальных

исследований

в

энзимологии,

образию живого. Ранее это разнообразие опи-

генетике бактерий и бактериофагов и биохимии

сывалось чисто феноменологически. Теперь фе-

нуклеиновых кислот.

номенологическое описание уступает место описа-

Основная тема книги раскрывается в части III,

нию регуляции генной экспрессии во времени и

где изложены концепции, лежащие в основе наших

пространстве на молекулярном уровне. В этой части

представлений

о генетических

информационных

рассматривается также, как с развитием методо-

системах эукариот. Введение к этой части знакомит

логии рекомбинантных ДНК биология преврати-

нас с отличительными особенностями геномов

лась из науки описательной в практическую. Гено-

эукариот. Речь идет об интронах и сложных сиг-

типы, а следовательно, и фенотипы на уровне ин-

налах, регулирующих транскрипцию, а также

о

дивидуальных белков, клеток и организмов можно

множестве повторяющихся

последовательностей

в

изменять, что позволяет в будущем исследовать

геноме и связанной с этим ролью обратной транс-

фундаментальные биологические процессы, а также

крипции в происхождении сегментов эукариоти-

решить острые вопросы, стоящие перед челове-

ческой ДНК. Раздел заканчивается описанием некой

чеством и планетой, которую мы населяем. Многие

объединяющей концепции, рассматривающей био-

из предоставляющихся возможностей можно будет

логическую эволюцию как процесс, в основе ко-

реализовать только после того, как мы лучше уз-

торого лежит перестройка нуклеиновых кислот и,

наем структуру геномов. Это касается определения

следовательно,

изменение

структуры

белковых

точного расположения генов и получения более

молекул.

полной информации об их нуклеотидных последо-

В первой из трех глав части III (гл. 8) при-

вательностях. В части IV излагаются также поло-

ведены данные о структуре генов эукариот и со-

жения, существенные для картирования и секвени-

временные представления о механизме их экспрес-

рования

геномов

некоторых

видов, в

том

числе

сии, в частности сведения о сложных сигналах регуля-

и человека.

ции транскрипции, а также о происхождении, локали-

В

1980 г.,

когда нам

впервые

пришла

мысль

зации

и структуре

интронов и

тех

механизмах,

о написании книги, мы, как и многие другие биоло-

с помощью которых интроны удаляются из пер-

ги, только что пережили период, когда научные

вичных транскриптов при сплайсинге. Очень су-

издания стали привлекать к себе столь же присталь-

щественным здесь явилось применение обратной

ное внимание, как и общественно-политические.

генетики–введение специфических мутаций в опре-

Ошеломляющие

успехи,

достигнутые

благодаря

деленные сегменты ДНК и последующий анализ

применению методологии

рекомбинантных

ДНК,

структурно-функциональных взаимоотношений в

были только одним из аспектов того, что называли

генах эукариот. В гл. 9 основное внимание сосре-

«революцией в биологии». Наряду с приходом но-

доточено на организации сложных эукариотических

вой эры в постижении сути живого эта революция

геномов. Рассмотрено расположение генов и других

вызвала беспрецедентное беспокойство обществен-

элементов в молекуле ДНК, в частности в центро-

ности о последствиях биологических экспериментов.

мерных и теломерных областях. Красной нитью

Вначале общественный интерес был связан с тем,

через всю главу проходит концепция генома как

что группа ученых-биологов подняла вопрос о без-

летописи эволюционной истории. В заключение

опасности экспериментов с рекомбинантными ДНК.

дано описание геномов внутриклеточных орга-

Людей, работающих с патогенными микроорга-

нелл–митохондрий и хлоропластов. В гл. 10 пред-

низмами, тоже беспокоила безопасность проведения

ставлены механизмы случайных и неслучайных

лабораторных

исследований.

Подобная

ситуация

перестроек геномной ДНК. Речь идет об ампли-

уже возникала в 1971 г., когда во всем мире стали

фикациях, делециях и транспозициях–как неза-

широко

использоваться

вирусы,

индуцирующие

программированных и приводящих к мутагенезу,

образование опухолей у экспериментальных живот-

так и запрограммированных в геноме и осуществ-

ных. Жизненный цикл этих вирусов отличался от

ляющих точную регуляцию генной экспрессии, на-

жизненного цикла более привычных вирусов (на-

пример изменение типов спаривания у дрожжей

пример, вирусов кори или полиомиелита), а неко-

и образование генов иммуноглобулинов.

торые

из

них,

вероятно, могли индуцировать рак

Вчасти IV дана краткая иллюстрация у человека. Это заставляло обратить самое серьез-

применения	общих принципов, рассмотрен-	ное внимание на потенциальную опасность таких
ных ранее,	к специфическим сложным биоло-	вирусов для ученых и студентов. Аналогичные опа-

8			ПРЕДИСЛОВИЕ
сения высказывались и в связи с появлением мето-				На конференцию были приглашены молекулярные
дов получения рекомбинантных ДНК. Общая ат-				биологи, вирусологи, микробиологи и биохимики
мосфера	озабоченности	усугублялась	глубоким	США и других стран, а также представители науч-
чувством	социальной ответственности,		возникшим	ной администрации, журналисты и юристы.
и окрепшим в Соединенных Штатах за предыдущее				Встреча состоялась		в феврале 1975 г. в Асило-
десятилетие борьбы за гражданские права и против				маре, шт. Калифорния, в конференц-центре на бе-
войны во	Вьетнаме.			регу Тихого океана, несколькими милями южнее
Первые эксперименты по созданию рекомби-				Гопкинсовской океанологической станции в Па-
нантной ДНК состояли в соединении ДНК, выде-				сифик-Гроу (при Станфордском университете).
ленной из вирусов, которые вызывали опухоли у				Организационный комитет провел предварительные
мелких лабораторных грызунов, с фрагментами				заседания рабочих групп, и эксперты в различных
ДНК из хорошо изученных вирусов. Намерения				областях подготовили документы для представле-
ввести эти новые молекулы ДНК в бактериальные				ния на конференции. Состоялась оживленная,
клетки вызвали серьезные нарекания, но вскоре				иногда жаркая, дискуссия о том, насколько реальна
было принято решение приостановить подобные				опасность	подобных экспериментов. Большинство
попытки, и все страсти улеглись. Следующим круп-				(но не все) участников признали, что риск появ-
ным шагом было конструирование рекомбинантной				ления особенно опасных организмов существует, но
ДНК, содержащей ген, который обеспечивал устой-				вероятность этого очень мала. Принятие оконча-
чивость бактерий к антибиотикам. Возможность				тельного решения о дальнейших действиях было
генетической трансформации живых клеток путем				отложено до тех пор, пока не скажут свое слово
введения необычных молекул ДНК в бактерии по-				юристы. Юристы же возложили персональную
ставила вопрос о том, что такие бактерии могут				юридическую ответственность за все последствия,
вызывать развитие опухоли или приобретут резис-				даже экстраординарные, на ученых. Они также на-
тентность к важным в медицинском отношении				помнили нам, что общество должно быть застра-
антибиотикам. Эти вопросы обсуждались как на				ховано от риска, если опасность последствий, пусть
научных конференциях, так и в частных беседах. На				крайне малая, существует. Позиции прояснились.
одной из таких конференций в июне 1973 г. участ-				Необходимо было следовать именно этому осно-
вующие в ней ученые решили привлечь внимание				ванному на здравом смысле курсу. В последний день
Национальной академии наук к этой перспективной				работы конференции был предложен предвари-
области исследований и попросить провести на-				тельный отчет Организационного комитета. Он
правленное исследование для оценки потенциальной				всесторонне обсуждался и был в конце концов при-
опасности манипуляций с рекомбинантными ДНК.				нят. Рекомендации		Асиломарской конференции
Чтобы придать гласность этому обращению, ученые				получили широкую огласку в прессе и были опуб-
опубликовали письмо в журнале "Science".				ликованы позже в ряде научных журналов. Не-
Академия, как обычно, сформировала комитет,				сколькими неделями ранее к аналогичным заклю-
куда вошли ученые, активно работающие с реком-				чениям пришел и возглавляемый лордом Эшби
бинантными ДНК и в смежных областях. Члены				правительственный комитет Великобритании.
комитета	встретились в	апреле 1974 г. и предло-		Рекомендации, принятые в Асиломаре, стали
жили два основных решения, ставших, к их удив-				основой и импульсом для официальных мероприя-
лению, новостью номер один. Во-первых, они				тий в США, начавшихся на следующий же день
призвали объявить всеобщий мораторий на те экс-				после закрытия конференции. Комитет, организо-
перименты с рекомбинантными ДНК, в которых				ванный	Национальными институтами здоровья
используется ДНК опухолеродных вирусов или в				(НИЗ), приступил к разработке директив по конт-
бактерии вводятся гены, детерминирующие токсины				ролю за всеми экспериментами с рекомбинантными
или ответственные за резистентность бактерий к				ДНК, проводимыми в институтах своего подчи-
антибиотикам. Во-вторых, они призвали к широ-				нения. Первые инструкции были весьма стро-
кому и свободному международному обсуждению				гими в расчете на то, что по мере накопления опыта
этих проблем на конференции, которую предпо-				и знаний они будут пересмотрены. По сей день не
лагалось провести следующей зимой.				выявлено ни одного нежелательного инцидента ни
Несмотря на ропот недовольства и даже обви-				с персоналом лабораторий, ни с кем-либо из других
нения в адрес ученых США в том, что они таким				людей, причиной которого были бы эксперименты,
образом пытаются затормозить работу ученых дру-				проведенные с рекомбинантными ДНК; а таких
гих стран и выиграть гонку в соревновании за				экспериментов насчитывается десятки тысяч. Со-
главные открытия, которые могут быть сделаны				держащиеся в документе требования к большинству
благодаря развитию новых методов, мораторий,				рутинных экспериментов с рекомбинантной ДНК
насколько	это известно,	был принят повсеместно.		изъяты или сделаны менее строгими. Жесткие тре-

ПРЕДИСЛОВИЕ

9

бования, согласно рекомендациям НИЗ, сохраняются только к тем экспериментам, в которых рекомбинантная ДНК содержит протяженные участки, полученные из ДНК особо патогенных микроорганизмов (этих рекомендаций придержи-

ваются и во многих других странах). Интересно отметить, что использование технологии реком-

бинантных ДНК сделало изучение некоторых важных, но опасных возбудителей инфекционных заболеваний человека и животных вполне доступным и безопасным.

Интерес общественности к экспериментам с рекомбинантными ДНК сохраняется по сей день и теперь распространяется также на генную инженерию целых организмов–бактерий, растений и животных. Сначала этот интерес и беспокойство были сосредоточены на том же, на чем основывались интерес и беспокойство большинства ученых – на возможности создания в эксперименте болезнетворных агентов. Местные власти и государственные органы издавали законы и указы, аналогичные рекомендациям НИЗ или даже более строгие. В конгрессе обсуждались предложения о придании рекомендациям НИЗ силы закона и установлении наказания за их несоблюдение, но ни одно из них не было принято. Огромное количество независимых дебатов – в разных местах и на разных уровнях–в конце концов узаконили причастность НИЗ к данной проблеме как в том, что касается оценки риска, так и в смысле административной организации.

Позже дискуссии приняли несколько иной характер. Некоторых ученых волнует вопрос о возможных эволюционных последствиях проникновения ДНК через видовые барьеры, например введение ДНК человека в клетки бактерий. Эти же вопросы задают и люди, не являющиеся учеными, однако данный аспект признан не заслуживающим большого внимания. В природе возникает неимоверное число возможностей для обменов ДНК подобного рода, и, по-видимому, они действительно происходят. Эксперименты с рекомбинантными ДНК лишь ненамного увеличивают их вероятность. Кроме того, большинство организмов, несущих рекомбинантные молекулы ДНК, мало жизнеспособны вне лаборатории. Этот последний довод приводился и при недавнем обсуждении вопросов, связанных с необходимостью правительственного контроля за преднамеренным распространением в окружающей среде важных в сельскохозяйственном отношении организмов, полученных методом генной инженерии. Конечно, подобные проблемы требуют внимания, но предъявление слишком строгих требований (например, использование защитной одежды, подобной костюму астронавта) с научной точки зрения необоснованно.

Постоянно обсуждается вопрос и о возможности применения техники рекомбинантной ДНК для создания биологического оружия. США присоединились к международной конвенции 1972 г., запрещающей проведение подобных работ, а Министерство обороны продолжает финансировать исследования по защите от биологического оружия, которое может быть создано в других странах. Это направление тоже интенсивно обсуждается, поскольку трудно определить грань, разделяющую работы, которые направлены на создание средств нападения и защиты. Такие проблемы одинаково волнуют как ученых, так и людей, не имеющих отношения к науке, поскольку они носят политический и социальный характер, а не чисто научный, как и другие проблемы, связанные с развитием новых направлений биологии. Что принесет человечеству генная терапия, если станет возможным ее применение,– пользу или вред? Как справиться обществу и отдельным гражданам с растущим потоком информации о человеческих генах, которые могут быть приобретены в результате применения новых технологий? Каковы этические проблемы, связанные с возможным введением генов человека в организмы животных? Надо ли патентовать животных и растения, полученные с помощью генной инженерии?

Озабоченность общественности, связанная с наступлением биологической революции, породила негативное отношение к данным исследованиям. Биологи опасались худшего: введения строгих правил или инструкций, которые могли серьезно помешать дальнейшей экспериментальной работе и, следовательно, не позволили бы получить новые многообещающие результаты и внедрить их в медицину, сельское хозяйство и промышленность. Многие ученые выражали сожаление о прекращении свободных дискуссий на эту тему. Подобные дискуссии противостояли демагогическим рассуждениям критиков и стремлениям устраивать шумиху в средствах массовой информации вокруг этих вопросов вместо внимательного их анализа. Но все

встало на свои места. Свидетельством тому служат научные достижения, описанные в этой книге, и

огромное количество очень полезных и важных продуктов, полученных в новой, бурно развивающейся биотехнологической промышленности. Может быть, мораторий и введенные вначале ограничения и задержали прогресс, но ненадолго. Возникшее в то время предубеждение против подобных исследований, по-видимому, можно оправдать неведением, и теперь с уверенностью можно сказать, что риск был гораздо меньше, чем мы могли предполагать.

Максин Сингер, Пол Берг