Основные способы окраски e. Canis.
От полноценности окраски риккетсий зависит продуктивность микроскопических исследований. Применяемый метод окраски должен удовлетворять основному требованию: окраска должна четко и контрастно выявлять как свободные, так и внутриклеточные, в том числе и внутриядерные формы риккетсий. Кроме того, техника окраски, применяемая в текущей работе с риккетсиями, должна быть простой, общедоступной и быстрой.
Снабженные липоидной оболочкой риккетсии плохо окрашиваются обычными бактериологическими красками. Лучше всего они окрашиваются азуровыми компонентами краски Романовского-Гимзы или обычным раствором азура II, а также карболовым фуксином и карболовым тионином. Также хорошо они выявляются с помощью серебрения.
Эффективность окраски риккетсий зависит и от реакции среды, причем наилучшие результаты получаются при окраске в слабощелочной среде (рН 7,4). Окрашенные азуровым компонентом или фуксином риккетсии удерживают окраску при последующей кратковременной обработке их слабой кислотой (лимонной или уксусной). На этой частичной кислотоустойчивости окрашенных риккетсий основана их дифференциация слабой кислотой и дополнительная фоновая докраска препарата в контрастный цвет (например, окраска риккетсий фуксином и докраска обесцвеченного препарата метиленовым синим).12
В сложившейся практике окраски риккетсий основным способом стало окрашивание по Романовскому-Гимзе, которое является классическим для выявления риккетсий внутри и вне клетки. Этот метод окрашивания был разработан Дмитрием Леонидовичем Романовским, когда он изучал малярийного плазмодия и исследовал мазки крови, взятой от больных малярией. До Романовского мазки крови рассматривали в естественном неокрашенном виде, и разобраться в увиденном было весьма сложно. Романовский в своих опытах смешивал синьку и эозин в разных количественных сочетаниях. После многочисленных опытов он однажды заметил, что смесь красок стала фиолетовой: в результате разложение синьки в растворе образовалась третья краска – азур.13 В своей диссертации Романовский пишет, что разрабатывать способ двойной последовательной окраски начал Хенцинский Ч.И., однако его метод не давал возможности подробно изучить строение малярийных паразитов. Романовский в своих опытах усовершенствовал способ Хенцинского.
Еще П. Эрлихом в работе «Farbenanalyse» было отмечено, что ядра большинства клеток красятся главным образом основными и нейтральными красками, поэтому работы Романовского были направлены на получение нейтрального красителя путем смешивания кислого эозина и щелочной синьки. В результате он получил смесь, которая обладала сильнейшей окрашивающей способностью при соотношении 1 части концентрированного раствора метиленовой синьки и двух частей 1% водного раствора эозина. При этом краска не теряла своей избирательности в отношении базофильных и эозинофильных частей клетки и одновременно хорошо окрашивала нейтрофильные ядра. То есть в составе смеси по-отдельности работали кислый эозин, щелочная синька и третья нейтральная краска – азур, которая получалась в результате смешения исходных двух.14
В результате применения этой смеси эритроциты окрашивались в розовый цвет, а проникшие в них малярийные паразиты – в небесно-голубой. Ядрышки паразитов блестели, как рубины, а продукты их жизнедеятельности – кровяной пигмент – были окрашены в темно-коричневый цвет.15
Таким образом Романовский разработал способ дифференцированной окраски мазков крови, который лег в основу многих других способов, направленных на выявление кровяных паразитов различного происхождения, в том числе и риккетсий.
Окраска риккетсий по Здродовскому является облегченной модификацией способа Циля-Нильсена. Этот способ основан на кислотоустойчивости риккетсий, окрашенных фуксином. Препараты окрашивают фуксином, дифференцируют слабой кислотой и дополнительно докрашивают синькой. В итоге риккетсии сохраняют окраску фуксина (красную), а тканевые элементы препарата окрашиваются в контрастный синий или голубой цвет. Особенно хорошо этим методом выявляются риккетсии ядерной локализации.
Для окраски риккетсий карбол-фуксин разводят в соотношении 10-15 капель на 10 мл бидистиллированной воды или фосфатного буфера при рН 7,4. материал, подлежащий исследованию, тонким слоем наносят на чистое предметное стекло, высушивают на воздухе и фиксируют обычным способом на пламени. разведенный карбол-фуксин наливают на стекло с препаратом, положенное горизонтально на подставку; окраска в таком виде длится 5 минут. затем препарат промывают водой и на 1-3 секунды погружают в ванночку со слабым раствором органической или минеральной кислоты (0,5% лимонной, 0,15% уксусной, 0,01% соляной). После обработки кислотой препарат хорошо промывают водой, а затем докрашивают в течение примерно 10 секунд 0,5% водным раствором метиленовой сини. Далее препарат промывают водой, подсушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют.
При использовании этого способа окраски надо учитывать, что свободные риккетсии легче обесцвечиваются кислотой по сравнению с внутриклеточными формами, а мелкие формы риккетсий легче, чем крупные. По данному способу хорошо окрашиваются лишь свежие препараты, а старые не дифференцируются кислотой и синькой, сохраняя однотонную фуксиновую окраску.16