27. Электрофорез белков: электрофорез с использованием додецилсульфата натрия

SDS-PAAG

В настоящее время электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН) [ДСН-ПААГ-электрофорез (SDS-PAGE)] является общепринятым методом определения гомогенности белковых препаратов. Метод основан на свойстве заряженных частиц (молекул) перемещаться под действием электрического поля. Обычно скорость миграции зависит от трех параметров анализируемых белков: величины молекул, формы молекул и суммарного заряда. Поэтому предварительно белки денатурируют с тем, чтобы скорость миграции зависела только от молекулярной массы. Для этого анализируемую смесь обрабатывают додецилсульфатом натрия [ДСН (SDS)] (C12H25OSO3Na), который представляет собой детергент с сильно выраженными амфифильными свойствами. Под действием ДСН олигомерные белки диссоциируют на субъединицы и денатурируют. Развернутые полипептидные цепи связывают ДСН (примерно 0,4 г/г белка) и приобретают отрицательный заряд. Для полной денатурации в среду добавляют тиолы, которые расщепляют дисульфидные мостики.

28. Принципиальное устройство ферментера.

Под ферментацией понимают процессы выращивания микроорганизмов для различных целей. Продуктом являются либо сами клетки (биомасса), либо какой-то полезный клеточный метаболит. Все операции должны проводиться в стерильных условиях, чтобы избежать загрязнения культуры. Исходные культуры организма, который должен использоваться в процессе ферментации, хранят в неактивной форме (например, в замороженном состоянии). Пробу активируют, наращивают в достаточном объеме с использованием асептических методов (наращивание) и затем добавляют в ферментер (инокуляция). В ферментере организм растет и размножается, используя питательную среду.

Существуют два основных типа ферментации, периодическая ферментация (или закрытая система) и непрерывное культинирование (или открытая система). При периодической ферментации, все необходимые ингредиенты вносятся до начала процесса; в ходе культивирования питательные вещества не добавляются и параметры ферментации не меняются. Именно поэтому процесс называется закрытой системой. Когда образуется достаточное количество продукта, процесс останавливают. Затем содержимое ферментера выгружают, выделяют продукт, выбрасывают использованные микроорганизмы, чистят ферментер и загружают его для нового культивирования.

Непрерывное культивирование представляет собой продолжительную, долговременную операцию, занимающую много недель, в ходе которой питательные вещества добавляют в среду по мере их расходования, а излишек культуры отбирают.

Непрерывное культивирование пока не находит широкого применения, однако в настоящее время все более популярным становится периодическое культивирование с добавлением субстрата, которое представляет собой компромисс между двумя системами. Использование периодического культивирования с добавлением субстрата делает процесс более контролируемым по сравнению с периодическим культивированием. Период роста удлиняется за счет того, что питательные вещества добавляются в низких концентрациях в процессе ферментации, а не вносятся все сразу в начале процесса. Одним из преимуществ метода является возможность регулирования скорости роста, которую можно соизмерять со скоростью подачи кислорода.

29. Плазмида pBR322, строение, свойства, принцип использования.

tet- участок, кодирующий белок устойчивости к тетрациклину

amp- участок, кодирующий белок устойчивости к ампицилину

Сайты рестрикции (всего около 40)

• PstI

• NdeI

• EcoRI

• EcoRV

• HindIII

• BamHI

• SalI

pBR322 содержит 4361 пару нуклеотидов и состоит из ori, гена ampR, кодирующего белок, обеспечивающий устойчивость к ампициллину и гена tetR, обеспечивающего устойчивость к тетрациклину. Плазмида содержит уникальные сайты рестрикции для более чем 40 рестриктаз. 11 из этих 40 сайтов находятся внутри гена tetR, причём 2 сайта HindIII и ClaI расположены внутри промотора этого гена. 6 сайтов находятся внутри гена ampR.

Наличие в плазмиде генов устойчивости к антибиотикам играет существенную роль в выделении бактерий со встроенным участком чужеродной ДНК.

Принцип использования

Задача: клонирование участка ДНК

Фрагмент ДНК, предназначенный для клонирования, вырезают с помощью рестриктазы, например Bam HI. Сайт используемой рестриктазы обязательно должен присутствовать в плазмиде внутри генов устойчивости к антибиотикам.

Далее плазмиды обрабатывают той же рестриктазой (Bam HI), которая разрезает кольцевую молекулу в сайте рестрикции (образуется линейный участок ДНК), и добавляют участки чужеродной ДНК. Поскольку на концах всех фрагментов ДНК находятся комплементарные последовательности нуклеотидов, они начнут «склеиваться», причём возможны два варианта склейки:

• Образуется восстановленная плазмида, которая идентична исходной

• Образуется кольцевая плазмида со встроенным фрагментом

Поскольку плазмиды со встроенным фрагментом являются целью процесса, необходимо выделить такие плазмиды и клонировать их. Процесс идёт следующим образом:

Плазмиды внедряются в клетки E. coli. Для этого клетки обрабатываются ионами Ca2+, что делает их мембраны проницаемыми для ДНК.

Полученные бактерии высевают на среду, содержащую ампициллин. В этой среде нормально растут колонии бактерий, содержащие плазмиды, остальные колонии угнетаются. По этому признаку можно отличить бактерии, содержащие плазмиды (любые плазмиды pBR322: восстановленные и модифицированные);

Колонии, содержащие плазмиды, перепечатываются на среду, содержащую тетрациклин. Поскольку чужеродная ДНК вклинивается внутрь гена tet, дезактивируя его, колонии бактерий с модифицированными плазмидами угнетаются тетрациклином. Таким образом они визуально отличимы от колоний бактерий с восстановленными плазмидами.

В результате этих действий выделяются колонии E. coli, в плазмиды которых встроен участок чужеродной ДНК. Они высеваются в обычную среду для дальнейшего клонирования.

Процедуру клонирования можно также вести с помощью других рестриктаз, например, Sal I и Pst I. В первом случае процесс будет аналогичен, в последнем бактерии с модифицированными плазмидами будут, наоборот, чувствительны к ампициллину и нечувствительны к тетрациклину.

30. Плазмида pET, строение, свойства, принцип использования.

Элемент системы векторов pET, отличный от других веркторов	Описание
Ori: pBR322 ori f1 ori (часто)	Ori взята из одноименной плазмиды, в которой она появилась от pMB1. Все плазмиды содержащие эту ori относятся к группе СolE1 и реплицируется только в E.coli. F1 есть в достаточно большом количестве pET’ах. Фазмиды это удобно, так как может развиваться как плазмида, так и как фаг.
Ген резистентности антибиотикам (AmpR) (KanR)	Либо от канамицина, либо от ампицилина
Промоторы и терминаторы (T7 p и Т7 t)	РНК-полимераза Т7 очень специфична к своему промотору и имеет низкий уровень ошибок, что помогает высокой производительности. Фермент стимулируется спермидином, активность воздрастает с бычим сывороточным альбумином. Т7 терминатор необходим, тк без него будет избыточная экспрессия гена резистентности к антибиотикам.

Если целевой продукт токсичен для Е.coli, то стоит использовать систему, где используется промотор Т7lac. Эти плазмиды используют lac-оператор после Т7 промотора. Также есть последовательность для lacl (репресор), направленный в противоположную сторону. Это позволяет репрессировать синтез РНК-полимеразы Т7 и, следовательно, синтез целевого белка.

32. Плазмида pUC19, строение, свойства, принцип использования.

pUC19 плазмида – кольцевая цепочка ДНК, состоит из 2685 пар нуклеотидов. Содержит:

1. точку начала репликации (ori),

2. ген N-концевого участка β-галактозидазы из E.coli LacZα (lacZ) с несколькими сайтами рестрикции,

3. ген устойчивости к ампициллину (amp^R)

Данная плазмида используется для селекции клонов, несущих рекомбинантный вектор по принципу отбора синее/белое. Для этого отбора необходимо использование штамма E.coli lacZΔM15. Этот штамм несет делецию в гене β-галактозидазы, поэтому такой штамм E.coli экспрессирует только ω-фрагмент этого фермента. Чтобы фермент «работал» ему необходим также α-фрагмент, ген которого присутствует в плазмиде pUC19.

Принцип отбора клона, несущих рекомбинантный вектор:

Культура высеивается на среде, содержащей ампициллин и X-Gal. X-Gal – это галактоза, соединенная с индолом.

1. Если клетки не содержат плазмиды pUC19, они не вырастают на среде, потому что не имеют гена устойчивости к ампициллину.

2. Если клетки содержат плазмиду pUC19, но не имеют вставки нужного гена, то в них экспрессируется ген LacZα, α и ω фрагменты фермента β-галактозидазы соединяются, и он «работает»: гидролизует X-Gal с образованием галактозы и индола. Индол димеризуется и образуется вещество синего цвета. Колонии клонов не несущих рекомбинантный вектор будут синими на чашке Петри.

3. Если клетки содержат плазмиду pUC19 и имеют вставку нужного гена (т.е. это клоны, несущие рекомбинантный вектор), то у них не экспрессируется ген LacZα, потому что в нем были сайты рестрикции, которые позволили вставить в это место нужный нам ген. Таким образом, α-фрагмента β-галактозидазы нет, X-Gal не гидролизуется, индол не образуются и искомые колонии остаются белыми.

33. Принцип использования металлохелатной аффинной (HisTag) хроматографии для выделения рекомбинантных белков.

Металлхелатная аффинная хроматография (МХАХ, Immobilised Ion Affinity Chromatography — IMAC) — классический метод очистки рекомбинантных белков, особенно широко применяющийся в научных исследованиях благодаря своей эффективности и простоте.