Вопрос 40. Культивирование вирусов в культурах тканей

1. Характеристики тканевых культур

2. Цитопатическое действие вирусов

1.Для культивирования вирусов используют ряд методов. Это культивирование в организме экспериментальных животных, раз­вивающихся куриных вибрионах и культурах тканей (чаще — эмбриональные ткани или опухолевые клетки). Для выращива­ния клеток тканевых культур используют многокомпонентные питательные среды (среда 199, среда Игла и др.). Они содержат индикатор измерения рН среды и антибиотики для подавления возможного бактериального загрязнения.

Культуры тканей могут быть переживающими, в которых жиз­неспособность клеток удается сохранить лишь временно, и растущими, в которых клетки не только сохраняют жизнедея­тельность, но и активно делятся.

В роллерных культурах клетки ткани фиксированы на плотной основе (стекло) — чаще в один слой (однослойные), а в суспензированных —взвешены в жидкой среде. По количеству пассажей, выдерживаемых растущей культурой тканей, среди них различают:

• первичные (первично-трипсинизированные) культуры тканей, которые выдерживают не более 5—10 пассажей;

• полуперевиваемые культуры тканей, которые поддерживаются не более чем в 100 генерациях;

• перевиваемые культуры тканей, которые поддерживаются в те­чение неопределенно длительного срока в многочисленных ге­нерациях.

Чаще всего используются однослойные первично-перевиваемые и перевиваемые тканевые культуры.

2. О размножении вирусов в культуре ткани можно судить по ци-топатическому действию (ЦПД):

• деструкции клеток;

• изменению их морфологии;

• формированию многоядерных симпластов или синтиция в ре­зультате слияния клеток.

• в клетках культуры ткани при размножении вирусов могут об­разовываться включения — структуры, не свойственные нор­мальным клеткам.

Включения выявляются в окрашенных по Романовскому-Гимзе мазках из зараженных клеток. Они бывают эозинофильные и базофильные.

По локализации в клетке различают:

• цитоплазматические;

• ядерные;

• смешанные включения.

Характерные ядерные включения формируются в клетках, за­раженных вирусами герпеса (тельца Каудри), цитомегалии и полиомы, аденовирусами, а цитоплазматические включения — вирусами оспы (тельца Гварниери и Пашена), бешенства (тель­ца Бабеша-Негри) и др.

О размножении вирусов в культуре ткани также можно судить по методу "бляшек" (негативных колоний). При культивирова­нии вирусов в клеточном монослое под агаровым покрытием на месте пораженных клеток образуются зоны деструкции моно-сом — так называемые стерильные пятна, или бляшки. Это дает возможность не только определить число вирионов в 1 мл сре­ды (считается, что одна бляшка является потомством одного вириона), но и дифференцировать вирусы между собой по фе­номену бляшкообразования.

Следующим методом, позволяющим судить о размножении вирусов (только гемагглютинирующих) в культуре ткани, мож­но считать реакцию гемадсорбции. При культивировании виру­сов, обладающих гемагглютжирующей активностью, может происходить избыточный синтез гемагглютининов. Эти моле­кулы экспрессируются на поверхности клеток культуры ткани, и клетки культуры ткани приобретают способность адсорбиро­вать на себе эритроциты — феномен гемадсорбции. Молекулы гемагглютинина накапливаются и в среде культивирования, это приводит к тому, что культуральная жидкость (в ней нака­пливаются новые вирионы) приобретет способность вызывать гемагглютинацию.

Наиболее распространенным методом оценки размножения вирусов в культуре ткани является метод "цветной пробы". При размножении в питательной среде с индикатором незараженных

клеток культуры ткани вследствие образования кислых продук­тов метаболизма она изменяет свой цвет. При репродукции вируса нормальный метаболизм клеток нарушается, кислые продукты не образуются, среда сохраняет исходный цвет.