Цитохімічні методи дослідження мікроорганізмів

Мікробна клітина — складна жива система. Кожна складова структури клітини має певну життєву функцію, а взаємодія окремих структур між собою забезпечує існування клітини, її цілісність. Для вивчення внутрішньої будови клітин застосовують спеціальні засоби забарвлення — цитохімічні методи дослідження. Більшість з цих методів переслідують і діагностичні цілі. За формою клітини мікроорганізмів не дуже різноманітні, і у ряді випадків, щоб встановити їх приналежність до того або іншого роду і виду, необхідно провести спеціальне забарвлення клітини або речовин, що накопичуються в ній. Існують прості і диференційовані методи забарвлення. При простому забарвленні використовують один барвник, наприклад метиленовий синій, фуксин, генциан фіолетовий в лужних або карболових розчинах. При цьому забарвлюється вся клітина. При диференційованому забарвленні окремі структури клітини забарвлюються кількома барвниками. До таких методів відносять забарвлення за Грамом, забарвлення спор.

1. Забарвлення клітин мікроорганізмів за Грамом

Цей метод диференціації мікробних клітин заснований на відмінності в хімічно­му складі клітинних оболонок. Суть метода полягає в тому, що в клітинах одних ви­дів мікроорганізмів в результаті забарвлення утворюється нерозчинна в спирті сполука йоду з основним барвником. В той же час в клітинах інших видів мікроорганіз­мів ця сполука з'являється тимчасово і після обробки спиртом розчиняється. Мікро­організми першої групи називають грампозитивними, другої – грамнегативними.

► ХІД РОБОТИ: ◄

1. На одномупредметному скельці по черзі готують мазки двох культур.

2. Мазок висушують на повітрі, фіксують над полум'ям пальника і забарвлюють протягом 2 хв розчином кристалічного фіолетового.

3. Потім барвник зливають і на препарат наносять на 1 хв розчин Люголя.

4. Р-н Люголя зливають, препарат обробляють спиртом протягом 15 – 20 с.

5. Препарат промивають водою та забарвлюють фуксином Пфейфера протягом 1 хв.

6. Барвник змивають водою, препарат висушують і мікроскопують з масляною імерсією.

7. Визначають, яка із запропонованих культур є грампозитивною, а яка грамнегативною: після цієї обробки грампозитивні мікроорганізми набувають темно-фіолетового кольору, а грамнегативні забарвлюються лише в колір додаткового забарвлення (фуксину).

8. Досліджувані мікроорганізми схематично зарисовують.

2. Забарвлення спор у бактерій

Спори бактерій в порівнянні з вегетативними клітинами мають високу стійкість до несприятливих умов зовнішньго середовища. Це округлі, овальні або еліпсовидні утворення. Якщо діаметр спори не перевищує діаметру клітин, в якій спора утворюється, клітину називають бацилярною, якщо перевищує, то залежно від розташування спори в центрі або на кінці клітини, цю клітину називають відповідно клостридіальною або плектридіальною. В бацилярній клітині спора може розміщуватися в центрі – центральне положення, на кінці – термінальне і ближче до одного з кінців — субтермінальне положення.

► ХІД РОБОТИ: ◄

1. На фіксований в полум'ї препарат спороутворюючих бактерій наливають метиленовий синій Леффлера, доводять його до кипіння і кип'ятять 15 – 20 хв, тримаючи скло над полум'ям.

2. Мазок промивають водою і дофарбовують протягом 30 с 0,5%-ним| водним розчином нейтрального червоного.

3. Ще раз промивають, підсушують і далі досліджують препарат з масляною імерсією об'єктиву. Спори забарвлюються в блакитний або синій колір, цитоплазма — в рожевий.

4. Результати спостережень зарисовують.