Промотор. Стадии транскр. цикла

Промотор генов прокариот, его структурные элементы. Стадии транскрипционного цикла. Инициация, образование «открытого комплекса», элонгация и терминация транскрипции.

Немного про РНК-полимеразу E.coli. Состоит из пяти субъединиц:

α , α’, β, β’, σ (слабо ассоциирована с комплексом)

Holoenzym-весь комплекс, core enzyme (минимальный фермент)- без σ.

Иоонообменная хромотография- разделение на две фракции- core enzyme и σ- фактор

Разная РНК- полимеразная активность:

Т4 и большинство других фагов имеют три группы генов, которые транскрибируются на разных этапах репликационного цикла фага:

1)Immediate Early (2 мин) Работает только клеточный транскрипционный аппарат

2)Delayed Early (2-10 мин) нужен хотя бы один вирус-специфичные белок, так как экспрессия этих генов блокируется ингибиторами синтеза белка

3)Late (10 – 25 мин) после начала синтеза фаговой ДНК

Только полный холофермент способен инициировать транскрипцию.

Сигма фактор обеспечивает образование стабильной связи между бактериальной РНК-полимеразой и ДНК матрицей в области промотора, то есть комплекс холофермента с ДНК более стабилен, чем комплекс минимального фермента с ДНК:

Был такой опыт: РНК полимеразу инкубировали с меченной ДНК фага Т7, после чего добавляли немеченую ДНК, инкубировали разные промежутки времени. Далее связанную ДНК-РНК-полимеразу сорбировали на нитроцеллюлозных фильтрах. Получили зависимость:

После того, как длина цепи РНК достигнет 8-9 оснований, сигма фактор высвобождается, и элонгация осуществляется минимальным ферментом)

Минимальный фермент может синтезировать РНК на ДНК матрице, но не может инициировать транскрипцию на определенном участке.

Стабильность специфических комплексов РНК полимеразы с ДНК увеличивается при повышении температуры: 37 С- стабильно, меньше 30-уже нет. Значит, локальная денатурация ДНК помощью хеликаз при 37 С- проще.

Размер денатурированного участка:

1)Гиперхромный эффект- разное поглощение

2) Агенты, модифицирующие денатурированные цепи

3) Подсчет числа супервитков в кольцевой ДНК- с помощью фореза

Теперь про промотор.

Промотор- последовательность ДНК, узнаваемая РНК-полимеразой, стартовая площадка транскрипции. Ассиметричен, что позволяет транскрибировать в правильном направлении, определять матричную цепь.

Рис. Структура промоторов Е. Coli

Сильные промоторы: хорошее соответствие консенсусу и правильный спейсинг

Слабые промоторы: существенные отличия от консенсуса в -35 and -10 районах

У прокариот промотор включает ряд мотивов, важных для РНК-полимеразы:

-10 область(=TATA-box) локализована между нуклеотидами -7 и -10

-35 область - между -30 и -35.

Расстояние между этими областями влияет на активность промотора - 17 п.о -

оптимально. Мутации тем сильнее ослабляют промотор, чем дальше новая

последовательность от канонической.

Сигма фактор определяет специфичность связывания РНК- полимеразы с промотором на ДНК. Имеются различные сигма-факторы, их сравнение выявила четыре консервативных участка:

1. Подавление неспецифического связывания с ДНК

2. Связывание с -10 боксом промотора (наиболее консервативный участок)

3. Связывание с -10 боксом промотора (факультативный участок)

4. Связывание с -35 боксом промотора

Определенный сигма-фактор- считывание определенной РНК. Разнообразие сигма- факторов:

сигма фактор узнаваемые промоторы структура промотора -35 бокс -10 бокс

s70 Большинство генов TTGACA TATAAT s32 Гены, активирующиеся при тепловом шоке TCTCNCCCTTGAA CCCCATNTA s28 Гены подвижности и хемотаксиса CTAAA CCGATAT s38 Гены стационарной фазы и ответа на стрессы ? ?

-24 Region -12 Region s54 Гены метаболизма азота CTGGNA TTGCA

Как понять, что элемент промотор? Промотор узнается у прокариот без каких либо дополнительных факторов.

Как, например, UP- элемент - AT- богатая последовательность. Является частью промотора, так как стимулирует транскрипцию РНК полимеразой в отсутствие дополнительных факторов.

Но сигма-фактор не связывается с UP элементом, с ним взаимодействует альфа-cубъединица С-концевым доменом.

На бета- субъединице- каталитический центр.

Реакция инициации:

1. Формирование закрытого комплекса. Термин «закрытый» означает, что ДНК в этом комплексе сохраняет свою двухцепочечную структуру. Этот процесс обратимый, поэтому для его описания используют константу равновесия.

2. Закрытый комплекс переходит в открытый в результате локального плавления фрагмента ДНК, связанного с ферментом.

3. Следующий шаг- включение первых двух нуклеотидов и образование фосфодиэфирной связи между ними. Это приводит к образованию тройного комплекса.

После присоединения 9 нуклеотидов требуется движение фермента. После добавления каждого основания существует вероятность, что фермент высвободит синтезируемую цепь. Это - абортивная инициация. В этом случае фермент должен начать синтез заново, с первого основания. В результате ряда абортивных инициаций может образоваться серия коротких олигонуклеотидов.

4)Высвобождение сигма-фактора. Начало элонгации. Скорость ухода полимеразы с промотора, чтобы следующий фермент мог узнать его определяет частоту инициации.

РНК-полимеразы бактерий движутся со скоростью 50-100 нт/с.

Холофермент - вид открытой клешни- узнал ДНК- закрылся.

Как определить, какой участок ДНК связан с РНК- полимеразой? Метод «защита от нуклеаз»

РНК полимераза защищает от нуклеазной атаки фрагмент ДНК протяженностью

~ 46 п.н. (от -44 до +3)

Сигма фактор используется многократно. Сейчас есть веские свидетельства того, что утрата сигма-фактора происходитне одномоментно в момент освобождения промотора, а случайным образом по ходу транскрипции.

Характерной особенностью РНК полимераз является наличие вторичного канала, через

который транспортируются предшественники. Нематричная цепь ДНК выпетливается из активного центра.

Молекула ДНК выпетливается из активного центра

Терминация транскрипции. В зависимости от того, требуются ли РНК-полимеразе для осуществления терминации дополнительные факторы, терминацию делят на две группы:

-Rho-зависимая

-Rho-независимая

Rho-независимые терминаторы состоят из последовательности, способной образовывать шпильку и Т-богатой последовательности.( U-богатый регион дестабилизирует РНК-ДНК дуплекс потому, что rU-dA связь слабая??) Около половины генов обладают таким терминатором.

Rho состоит из шести субъединиц, каждая обладает АТФазной активностью. Rho связывается с определенными С-богатыми последовательностями в новосинтезированной РНК и начинает перемещаться, догоняя движущуюся полимеразу. Терминация происходит в тот момент, когда полимераза делает паузу на шпилечной структуре. Rho разрушает ДНК-РНК гибрид за счет присутствующей хеликазной активности. Зависящие от Rho терминаторы не содержат T-богатой последовательности.