Рис. 2.7. Различные стадии седиментации макромолекул

Применение аналитического ультрацентрифугирования биологии:

•Определение молекулярных масс

•Оценка чистоты препаратов. Аналитическое ультрацентрифугирование широко применяется для оценки чистоты препаратов ДНК, вирусов и белков. Чистота препаратов, несомненно, очень важна в тех случаях, когда требуется точно определить молекулярный вес молекулы.

•Исследование конформационных изменений в макромолекулах. Молекула ДНК, например, может быть одноили двухцепочечной, линейной или кольцевой. Под действием различных соединений (таких, например, как органические растворители) или при повышенных температурах ДНК претерпевает ряд обратимых и необратимых конформационных изменений, которые можно установить по изменению скорости седиментации образца. Различия в скорости седиментации образца до и после различных воздействий на него позволяют обнаруживать конформационные изменения, происходящие в макромолекулах.

26

родой определяемых ионов или ионов титранта, а также удобством

работы с электродом и др. факторами.

Рис. 8.1. Схема потенциометрической цепи для измерения э.д.с. электрохимического элемента

Электроды. Все равновесные электроды разделяются на две основные группы, связанные с наличием или отсутствием электродных реакций. Дальнейшая классификация обычно проводится по природе веществ, участвующих в электродном процессе.

Группа электродов с электрохимической реакцией достаточно представительна. Если в реакции наряду с металлом принимают участие его простые или комплексные ионы, то говорят об электродах I рода. К ним относят и амальгамные. Потенциал таких электродов обратим по ионам металла, выступающим в качестве потенциалопределяющих.

При погружении металла в раствор, анионы которого (Cl-, OH-, S2 -) образуют с катионами металла труднорастворимое соединение, покрывающее поверхность металла, получается электрод II рода. Типичным является хлоросеребряный (рис.8.2):

AgCl + = Ag + Cl–,

потенциал которого обратим по ионам Cl–. Стандартные потенциалы электродов I и II рода, созданных на основе одного и того же металла, связаны через произведение растворимости трудно растворимого соединения. Менее распространены электроды III рода, в которых металл контактирует с двумя труднорастворимыми соединениями, обладающими общим анионом.

Металл электрода может непосредственно не участвовать в электродной реакции (Pt, Au), но способствовать передаче электронов между растворимыми Ох- и Red-формами реагента: Cu2+ + ē = Cu+; и т.д. Зачастую в окислительно-восстановительную реакцию включаются иные компоненты раствора, в частности Н+, как в хин-

115

обусловленной ориентацией в электрическом поле частиц

(молекул, ионов), обладающих дипольным моментом. Методы диэлектрометрии применяют для контроля чистоты диэлектриков, например для определения малых количеств влаги.

2 Потенциометрия. Виды электродов

Потенциометрические методы анализа основаны на зависи-

мости эдс обратимых электрохимических цепей от концентрации (активности) определяемого вещества. Такая зависимость описывается уравнением Нернста:

В этом уравнении Е Me+/Me – ЭДС реакции, в Е0 Me+/Me – стандартный потенциал, в

R– универсальная газовая постоянная, 8,312 Дж/моль·К

n – число электронов, участвующих в электронной реакции, F – число Фарадея, 96500 Кл/моль.

Простейшая потенциометрическая ячейка содержит 2 электрода (рис.8.1): потенциал одного из них прямо или косвенно зависит от концентрации определяемых ионов – его называют индикаторным;

ивторой электрод, относительно которого измеряется потенциал индикаторного электрода, называемый электродом сравнения. Ионы, от концентрации которых непосредственно зависит потенциал электрода, называют потенциалопределяющими для данного электрода.

Если потенциалопределяющие ионы индикаторного электрода

иэлектрода сравнения совместимы и концентрация их взаимно не влияет на электродный потенциал другого электрода, то оба электрода могут быть помещены непосредственно в анализируемый раствор, содержащий оба вида потенциал определяющих ионов. В этом случае эдс ячейки будет соответствовать потенциалу индикаторного электрода, измеренному относительно данного электрода сравнения. Чаще электрод сравнения электрод сравнения помещают в другой раствор, который при помощи электролита, соединяют с анализируемым (рис.8.1).

Выбор индикаторного электрода при потенциометрическом титровании определяется типом протекающей реакции, либо при-

114

Лекция 3 ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

1Принцип метода электрофореза

2Факторы, влияющие на подвижность молекул, веществ

3Специальные электрофоретические методы

1 Принцип метода электрофореза

Электрофоретические методы основаны на разделении ионов при движении их в растворе под действием электрического поля. Разделение биологического материала с помощью электрофореза происходит по двум причинам. Во-первых, многие важные в биологическом отношении молекулы (аминокислоты, пептиды, белки, нуклеиновые кислоты) содержат ионизующиеся группы, поэтому в растворе они могут существовать в либо в виде катионов, либо анионов. Во-вторых, если макромолекулы по величине заряда близки, то они, вероятно, будут различаться молекулярными массами, то есть разделение этих веществ будет осуществляться за счет разного отношения заряда молекулы к массе.

Подлежащий электрофоретическому разделению материал растворяют или суспендируют в буферном растворе; чтобы обеспечить проведение электрического тока, этим же буфером насыщают и носитель. Ток в цепи поддерживается за счет электролиза, происходящего на электродах, каждый из которых погружен в большую буферную камеру. В процессе электролиза на катоде образуются гидроксид-ионы и молекулярный водород, а на аноде – молекулярный кислород и ионы водорода:

К: 2 Н2О + 2ē → Н2↑ + 2 ОН–

А: 2 Н2О – 2ē → О2↑ + 4 Н+

Образование на катоде гидроксильных ионов приводит к увеличению диссоциации компонента буферной смеси, представляющего собой слабую кислоту (НА). Вследствие этого возрастает количество ионов А–, проводящих ток к аноду. На аноде ионы А– соединяются с протонами, при этом снова образуется НА, а электроны поступают в электрическую цепь.

Оборудование. Прибор для электрофореза, состоит в основном из двух частей: источника питания и собственно электрофоре-

27

тического блока. Описываемое оборудование применяется для ра-

боты с низким напряжением до 500 В и силой тока до 150 мА, а высоковольтный электрофорез – более специальный метод, который рассмотрен ниже.

В электрофоретический блок входят электроды, буферные ка-

меры, опора для носителя и прозрачная изолирующая крышка

(рис. 3.1; 3.2). Можно пользоваться электродами из нержавеющей стали, но поскольку некоторые буферы вызывают коррозию, предпочтительнее платиновые электроды. Обе буферные камеры обычно разделены на два отсека: электродное отделение и отделение для фитиля-мостика. Электрический контакт между буферными растворами в обоих отделениях осуществляется за счет маленьких отверстий (щелей) в перегородке между отделениями или с помощью фитилей. Разделение камеры на отсеки нужно для того, чтобы изменение рН буферного раствора, происходящее у электрода, не сказывалось на буферном растворе, которым насыщен носитель.

Рис. 3.1 Прибор для горизонтального электрофореза

1 – носитель; 2 – крышка; 3 – электрод; 4 – отсеки буферной камеры; 5 – изолирующая пластина; 6 – фитиль-мостик.

Контакт между носителем (заранее насыщенным буфером) и буферным раствором, находящимся в камерах, обычно поддерживается с помощью фитилей-мостиков из нескольких слоев фильтровальной бумаги или марли. При низковольтном электрофорезе на бумаге можно обойтись без мостиков – контакт создается за счет непосредственного погружения бумаги в буферный раствор.

Насыщенный буфером носитель, на который нанесен образец, обычно располагают горизонтально (горизонтальный электрофорез) на плоской поверхности изолирующего материала (рис. 3.1). Для работы с низким напряжением имеется простое оборудование для вертикального электрофореза (рис. 3.2). В этом случае в каче-

стве носителя используют пластины крахмального геля, помещая

28

рию и диэлектрометрию.

•Потенциометрия объединяет методы, основанные на измерении эдс обратимых электрохимических цепей, когда потенциал рабочего электрода близок к равновесному значению. По-

тенциометрия включает редоксметрию, ионометрию и потенциометрическое титрование.

•Вольтамперометрия основана на исследовании зависимости тока поляризации от напряжения, прикладываемого к электрохимической ячейке, когда потенциал рабочего электрода значительно отличается от равновесного значения. По разнообразию методов вольтамперометрия - самая многочис-

ленная группа из всех электрохимических методов анали-

за, широко используемая для определения веществ в растворах и расплавах (например, полярография, амперомет-

рия).

•Кулонометрия объединяет методы анализа, основанные на и з-

мерении количества вещества, выделяющегося на электроде

в процессе электрохимической реакции в соответствии с Фарадея законами. При кулонометрии потенциал рабочего электрода отличается от равновесного значения. Различают потенциостатическую и гальваностатическую кулонометрию, причём последняя включает прямой и инверсионный методы, электроанализ и кулонометрическое титрование.

• К кондуктометрии относятся методы, в которых измеряют электропроводность электролитов (водных и неводных растворов, коллоидных систем, расплавов, твёрдых веществ).

Кондуктометрический анализ основан на изменении кон-

центрации вещества или химического состава среды в межэлектродном пространстве; он не связан с потенциалом электрода, который обычно близок к равновесному значе-

нию. Кондуктометрия включает прямые методы анализа

(используемые, например, в солемерах) и косвенные (например, в газовом анализе) с применением постоянного или переменного тока (низкой и высокой частоты), а также

хронокондуктометрию, низкочастотное и высокочастотное титрование.

• Диэлектрометрия объединяет методы анализа, основанные на измерении диэлектрической проницаемости вещества,

113