Биоиндикация предусматривает выявление уже состоявшегося или накапливающегося загрязнения по индикаторным видам живых организмов и экологическим характеристикам сообществ организмов. Для отдельных организмов к интегральным параметрам обычно относят характеристики выживаемости, роста, плодовитости, тогда как физиологические, биохимические, гистологические и прочие параметры относят к частным. Для популяций интегральными параметрами являются численность и биомасса, а для экосистем — характеристики видового состава, активности продукции и деструкции органического вещества.

Суть методологии биотестирования

Методология биотестирования, основанная на исследовании эффективности процессов гомеостаза, позволяет уловить присутствие стрессового воздействия раньше, чем многие обычно используемые методы.

Требования к методам биотестирования

Методы биотестирования должны соответствовать следующим требованиям: быть применимыми для оценки любых изменений среды обитания живых организмов, быть достаточно чувствительными для выявления экологических изменений, быть применимыми для любого вида живых существ, быть удобными для моделирования, быть достаточно простыми и дешевыми.

Подходы ≪Подходами≫ можно назвать группы методов, характеризующих сходные процессы, происходящие с тест- объектами под влиянием антропогенных факторов.

Генетический подход

В норме большинство генетических нарушений распознаются и элиминируются клеткой, например путем апоптоза за счет внутриклеточных систем или посредством иммунной системы. Достоверное превышение спонтанного уровня таких нарушений является индикатором стресса.

Генетические изменения могут выявляться на генном, хромосомном и геномном уровнях. Принято выделять следующие типы мутаций. Генные, или точковые, — их делят на две группы: замены оснований в ДНК и вставки или выпадения нуклеотидов, приводящие к сдвигу рамки считывания генетического кода. Генные мутации делят также на прямые и обратные (реверсии). Мутации типа сдвига рамки считывания значительно менее склонны к спонтанным реверсиям, чем мутации типа замен оснований. Хромосомные перестройки (аберрации) заключаются в различных нарушениях структуры хромосом. Геномные мутации — изменение количества хромосом в ядре.

Относительно просты, хорошо воспроизводимы и высокочувствительны генетические тесты, основанные на оценке измене38 ния хромосом в соматических клетках (изменения кариотипа, хромосомные аберрации, сестринские хроматидные обмены, микроядра и др.).

Для выявления канцерогенов и мутагенов применяются краткосрочные генетические тесты.

Поскольку на проведение тестов уходит значительно меньше времени, чем на классические долгосрочные исследования на грызунах, их стали называть краткосрочными тестами.

Наиболее часто употребляемым в оценке степени мутагенности среды тестом является тест Эймса. Для создания тест-системы Б. Н. Эймсом и его сотрудниками были сконструированы специальные штаммы бактерий. На основе штаммов сальмонеллы были созданы полуколиче- ственные и количественные тесты для оценки мутагенной активности. Количественные тесты целесообразно использовать в целях определения частоты мутаций, а также в тех случаях, когда исследуемые вещества являются высокотоксичными и вызывают гибель большей части клеток тест-объекта. Поэтому наиболее широкое распространение получил ставший классическим полуколи- чественный тест Эймса с метаболической активацией т уИго

Суть метода Эймса заключается в регистрации способности испытуемого соединения и (или) его метаболитов индуцировать генные мутации у индикаторных микроорганизмов в системе метаболической активности in vitro.

Метаболитом выступает печень крысы.

Мутагенные и канцерогенные вещества

Физической природы

Ионизирующие излучения (γ-, β-, α-, рентгеновское излучения, нейтроны)

Неионизирующие излучения (УФ-излучение)

Химической природы

Алкилирующие соединения

Пероксиды

Альдегиды

Гидроксиламины

Азотистая кислота

Соли тяжелых металлов

Акридиновые красители

Другие вещества: гербициды, инсектициды, некоторые лекарственные вещества

Биологической природы

Инородное ДНК

Бактерии в качестве тест-объектов

Преимущества

1.Легкость культивирования в лабораторных условиях,

2.Короткий жизненный цикл,

3.Возможность работать с большими популяциями клеток (статистика).

4.Разработан широкий арсенал методов, позволяющих изучать летальные и генетические эффекты, а также механизмы биологического действия повреждающих агентов.

E.coli и Salmonella typhimurium

Наиболее подробно изучены в генетическом и биологическом отношении.

Выделено около 50 мутантных штаммов E.coli и около 25 S. typhimurium.

Мутантные популяции отличаются резистентностью к ДНК-повреждающим агентам по сравнению с дикими клетками.

Открытые на бактериях процессы репарации оказались присущи и клеткам млекопитающих.

Таким образом, исследования на бактериях не исключая и не заменяя исследования на других объектах, формируют логику таких исследований.

Бактерии в качестве тест-объектов

Недостатки

1.Не существует надежной количественной связи между способностью повреждающего агента индуцировать мутации у бактерий с развитием повреждений ДНК у животных и человека.

2.Не способны выявлять химические вещества, вызывающие рак не в результате повреждения ДНК, а посредствам других механизмов, которые еще плохо изучены.

Несмотря на указанные ограничения, тесты на бактериях в высшей степени пригодны в качестве первичной оценки мутагенных и канцерогенных эффектов, а также при анализе аддитивности, синергизма и антагонизма комбинированных воздействий факторов физической и химической природы.

Растения в качестве тест-объектов

Термин «мутация» был предложен голландским ботаником де Фризом в 1909 г. для обозначения случайных наследственных изменений у растений.

Преимущества

1.Хорошо изучен генетический аппарат растительных клеток.

2.Возможность получения репрезентативных генетически однородных выборок.

3.Низкая частота спонтанных мутаций.

4.Простота учета генетических эффектов.

5.Короткие сроки вегетации.

6.Простота проведения экспериментов.

7.Возможность получения нужных объемов выборок.

8.Высокая чувствительность.

9.Высокая воспроизводимость результатов.

Растения в качестве тест-объектов

Недостатки

1.Отсутствие информации о механизмах влияния на метаболизм растений ксенобиотиков.

2.Прочная целлюлозная оболочка препятствует проникновению в клетку отдельных химических веществ.

3.Клетки высших растений содержат больше цитоплазматической ДНК, чем клетки животных.

АНАФАЗНЫЙ МЕТОД

Заключается в подсчитывании нормальных и аномальных анафаз и телофоз в делящихся клетках.

Вычисляют процент клеток с аберрациями от общего числа клеток, находящихся в этих же фазах деления.

Метод удобен для анализа растений с большим числом хромосом и/или с плохо изученной морфологией.

Анафазный тест и аллиум-тест

Хромосомные абррации

МЕТАФАЗНЫЙ МЕТОД.

Учет аберраций хромосом в клетках апикальной меристемы растений.

1. Изучение на стадии метафазы.

2.Хромосомы каждого кариотипа обладают постоянством числа, формы и внутренней структуры.

Принцип метода основан на учете образованных хромосомных аберраций в клетках апикальной меристемы растений после обработки семян мутагенами.

Хромосомы: акроцентрические(палочковидные), субметацентрические(неравноплесие), метацентрические (равноплечие).

Растения тест-объекты генотоксичности среды

Конские бобы (Vicia faba) – 12 n,

Лук (Allium cepa) –16 n,

Традесканция (Tradescantia paludosa) – 12 n,

Кукуруза (Zea mays) – 20 n,

Ячмень (Hordeum vulgare) – 14 n,

 Соя (Glycine max) – 12 n.

Учет аберраций хромосом в клетках корневой меристемы растений

Готовятся «давленные» препараты из апикальной меристемы и окрашиваются ацетоорсеином (ацетокармином).

В каждом препарате анализируются все метафазы.

Учитывается долю клеток с аберрациями хромосом.

Обзор методов оценки генотоксичности среды

Оценка по мейотическому индексу

Для оценки стабильности мейоза используют интегральный показатель – мейотический индекс, который представляет собой процент нормальных тетрад к общему числу изученных клеток.

При мейотическом индексе 90% и выше растение считается цитологически стабильным, т.е. оно будет воспроизводить в потомстве число хромосом.

Оценка по митотическому индексу

Митотическая активность ткани определяется относительным числом клеток, находящихся в митозе.

Митотический индекс (МИ) – это отношение числа клеток, находящихся в митозе, к общему числу клеток исследуемой ткани (чаще всего на 1000 клеток).

Принцип метода оценки мутагенного воздействия факторов основан на учете соматических мутаций в клетках волосков тычинок традесканции.

Генетические тесты на животных

Мутагенные вещества можно оценить в отношении их способности индуцировать хромосомные повреждения у млекопитающих и насекомых.

Обычной тест-системой является культура клеток млекопитающих (например, культура лимфоцитов человека, клетки костного мозга лабораторных животных ).

Лимфоциты периферической крови человека в качестве тест-системы

не способны к делению в культуре,

могут быть стимулированы путем обработки митогеном (например, фитогемагглютиннином (ФГА),

 культуру получают из образца свежевзятой крови и проводят культивирование на протяжении нескольких циклов делений.

Генетический тест оценки мутагенной активности вещества по частоте образования хромосомных аберраций

Хромосомные аберрации анализируются в метафазах митотического деления клеток пролиферирующих тканей.

Типы аберраций хромосом

На верхнем рисунке сестринские хроматидные обмены.

На рисунке внизу метафазная пластинка с дицентриком.

Балльная шкала

для получения интегральной характеристики цитогенетического состояния живых организмов

1 балл – условно нормальное состояние – частота аберрантных клеток до 5% (в лимфоцитах человека 1 – 2%).

2 балла – низкая степень изменения – частота аберрантных клеток в пределах 6 – 10%.

3 балла – средняя степень изменения – частота аберрантных клеток в пределах 11 – 15%.

4 балла – высокая степень изменения – частота аберрантных клеток в пределах 16 – 20%.

5 баллов – критическое состояние – частота аберрантных клеток выше 20%.

Микроядерный тест

заключается в количественной регистрации микроядер в клетках, находящихся на стадии телофазы митоза.

лимфоциты периферической крови сохраняют полученные повреждения в течение длительного времени.

Микроядра обнаруживаются в лимфоцитах сразу после первого митоза.

Для построения дозовой зависимости кровь облучают in vitro (или вносят в культуру мутаген) и спустя 72 ч от начала ФГА-стимуляции анализируют.

Принцип метода заключается в образовании микроядер вследствие нарушения распределения генетического материала между дочерними клетками (5%) или формирующихся из обломков хромосом (до 95%) при митотическом делении.

Подсчитывают обычно 500 бинуклеарных клеток, используя метод цитокинетического блока (цитохолазина-Б блокирует разделение цитоплазмы).

Возможность применения теста для биодозиметрии ограничена 2 – 4 годами после облучения.

Для проявления биологического эффекта в лимфоцитах крови необходимо, вероятно, несколько месяцев, т.ч. существует органические и «снизу».

Правила подсчета микроядер

Микроядра имеют округлую или овальную форму и обладают типичной ядерной окраской,

в цитоплазме одной бинуклеарной клетки может присутствовать одно микроядро и более,

микроядра меньше половины основного ядра,

регистрировать следует те микроядра, между которыми и основным ядром четко выявляется ядерная мембрана.

Реконструкция дозы γ-облучения по микроядерному тесту

При дозах от 1 до 4 – 5 Гр увеличение количества микроядер в клетках линейно для всех видов излучений.

При дозах от 0.05 до 2 Гр выход микроядер описан линейно-квадратичной зависимостью.

В диапазоне доз 0.05 – 0.1 Гр имеется плато (дозонезависимый участок).

Микроядерный тест на растительных объектах

Проращивание традесканции

Фиксация

Препарирование и окрашивание

Морфологический подход

Для диагностики воздействия загрязнений на морфологические характеристики применяются методы оценки флуктуирующей асимметрии. Флуктуирующая асимметрия является результатом неспособности организмов развиваться по точно определенному плану. Различия между сторонами не являются генетически детерминированными и не имеют адаптивного значения. Выступая в качестве меры стабильности развития, флуктуирующая асимметрия характеризует состояние морфогенетического гомеостаза — способности организма к формированию генетически детерминированного фенотипа при минимальном уровне онтогенетических нарушений.

Флуктуирующая асимметрия — это один из общих онтогенетических показателей, характеризующий стабильность индивидуального развития, дающий оценку состояния природных популяций и зависящий от состояния среды. Величина флуктуирующей асимметрии и ее зависимость от определенных факторов может быть определена лишь на популяционном уровне. Кроме того, В. М. Захаровым показано, что флуктуирующая асимметрия является практически единственной формой фенотипической изменчивости с известной причиной обусловленности.

Последствия нарушений в индивидуальном развитии могут быть выявлены

по частоте встречаемости морфологических отклонений (фенодевиантов),

по величине показателей флуктуирующей асимметрии (отклонение от совершенной билатеральной и радиальной симметрии),

методом анализа сложно организованных комплексных структур (фрактал-анализ).

Типы

Асимметрии: Направленная

асимметрия

(сердце

млекопитающих ),

Антиасимметрия

(правша и

левша в популяции

человека),

Флуктуирующая

Асимметрия

Флуктуирующая асимметрия

является мерой стабильности развития,

результатом неспособности организмов развиваться по точно определенному плану в условиях антропогенной нагрузки.

Различия между сторонами билатерального организма не являются генетически детерминированными и не имеют адаптивного значения.

Флуктуирующая асимметрия

один из общих онтогенетических показателей,

характеризует стабильность индивидуального развития,

дает оценку состояния природных популяций,

зависит от состояния среды.

Ячмень, овес и пшеница используются для оценки воздействия на агроценозы

• Для анализа берут флаговые (самые верхние, одноколосовые) листья.

•Минимальный размер выборки – 25 растений.

•Анализируется ширина левой и правой половинки листа от главной жилки.

Водная биоиндикация

Водные растения имеют в основном дуговое жилкование.

Используют рдест пронзеннолистный (Potamogeton perfoliatis) и рдест плавающий (P.natans)

На рисунке

1.Ширина половины листовой пластины,

2.Расстояние от центральной до первой жилки,

3.Расстояние между первой и второй жилками,

4.Расстояние от середины листа до основания первой жилки.

Биоиндикация воздуха

Влияние суммарного загрязнения почвы (в долях ПДК) на асимметрию листьев тополя бальзамического

1.Береза бородавчатая, 2. Тополь бальзамический, 3. Клен остролистный, 4. Мать-и-мачиха обыкновенная, 5. Клен американский, 6. Сныть обыкновенная, 7. Клевер ползучий.

Зооиндикация почвы

Широко используются жужелицы (Pterostichus melanarius, Patrobus atrorufus (на рисунке варианты учитываемых признаков на надкрыльях), Pterostichus oblongopunctatus) – наиболее массовые представители почвенной мезофауны.

Флуктуирующая асимметрия ЖИВОТНЫХ для оценки качества среды

1 Оценка стабильности развития рыб проводится по флуктуирующей асимметрии и частоте фенодивиантов пяти признаков карася золотого (Carassius carassius) и карася серебряного (Carassius auratus).

Оценка стабильности развития земноводных проводится по флуктуирующей асимметрии 13 признаков бесхвостых амфибий – зеленых лягушек Rana lessonae и R. Esculenta

•Возможность прижизненной оценки ограничена признаками внешней морфологии.

• Можно оценивать изменчивость параметров яиц внутри кладки и асимметрию щитков на цевке и пальцах у птенцов.

Оценка стабильности развития млекопитающих проводится по флуктуирующей асимметрии 10 признаков рыжей полевки (Clethrionomys glareolus)

и обыкновенной бурозубки (Sorex araneus)

БИОТЕСТИРОВАНИЕ ЗАГРЯЗНЕНИЯ ВОДЫ С ПОМОЩЬЮ РЯСКИ МАЛОЙ (Lemna minor L.) Представители семейства рясковых

• самые маленькие цветковые растения,

• имеют крайнюю степень редукции всех органов,

•по простоте строения занимают первое место среди цветковых растений,

• водные, свободно плавающие, многолетние травянистые растения

Принцип метода основан на определении гибели и изменений в темпах роста ряски (на графике), учете морфологических изменений (хлорозы, некрозы поверхности листеца, расслоение листецов) при воздействии токсических веществ в исследуемой среде по сравнению с контролем.

НАРУШЕНИЕ ЭМБРИОНАЛЬНОГО МОРФОГЕНЕЗА АМФИБИЙ

В раннем эмбриогенезе имеются особо чувствительные к повреждающим воздействиям фазы («критические периоды»), которые связанны с межклеточными взаимодействиями при морфогенезе.

Метод оценки токсичности среды по нарушению ЭМБРИОНАЛЬНОГО МОРФОГЕНЕЗА АМФИБИЙ

основан на определении физиологического состояния зародышей амфибий по морфологическим аномалиям и смертности.

 Применение эмбриональных моделей позволяет сделать предположения о механизмах повреждения, используя в качестве биотестов эмбрионы на разных стадиях развития

В качестве тест объекта используются эмбрионы лягушки на стадии закладки нервной системы (нейруляции).

Эта фаза развития характеризуется резким повышением уровня окислительного метаболизма и инициацией экспрессии генов, связанных с начальными процессами дифференцировки.

Физиологический подход

Одна из наиболее важных характеристик, высокочувствительная к стрессовому воздействию среды, — энергетика физиологических процессов. Для характеристики энергетического обмена две величины являются фундаментальными: основной обмен и максимальный обмен. Основной обмен отражает минимальный уровень потребления энергии, необходимый для обеспечения нормального функционирования организма при отсутствии каких-либо внешних воздействий. Максимальный обмен соответствует предельному количеству энергии, которое организм способен выработать в случае необходимости. Разность между этими величинами представляет энергетический ресурс адаптации конкретного вида животных, поскольку основной и максимальный уровни обмена являются видоспецифическими величинами.

Другая базовая характеристика, перспективная для оценки стрессовых воздействий, — темп и ритмика ростовых процессов

Важной характеристикой физиологических процессов является поведенческая активность живых организмов В качестве тест-функций применяются физиологические параметры пресноводных беспозвоночных гидробионтов разных уровней филогенеза.

Наибольший интерес представляют типы поведения, относящиеся к эволюционно-универсальным реакциям, свойственным всем эукариотам, включая человека. К таким феноменам относятся спонтанная двигательная активность как врожденная форма поведения и память — приобретенная форма поведения. В опытах на инфузориях показателями исходного функционального состояния служили объективно регистрируемые реакции: спонтанная двигательная активность, уровень спонтанных сокращений, уровень пищевой возбудимости, состояние ядерного аппарата. Была продемонстрирована применимость основных физиологических показателей, используемых в опытах на позвоночных животных, для определения функционального состояния организмов, лишенных нервной системы. Исследования поведенческих реакций в ответ на внешнее воздействие проводились на пресно- водной гидре Иуйга анепиа(е, имеющей примитивную нервную систему. Оценивались реакции привыкания к раздражителю, при этом критерием выработки привыкания служило сокращение щупалец гидры. В экспериментах на плоских червях планариях Ро1усеИ$ пщга, Еир1апапа %опосерка1а, Хщппа (примитивный мозг — зачатки цефализации) были изучены основные реакции гидробионтов на экологически значимые раздражители. В дальнейшем для оценки качества водной среды стал успешно применяться метод выработки условных рефлексов у планарий.

Организация наблюдений за загрязнением поверхностных вод Для правильной оценки качества воды в водоеме, характеристики его химико-биологического состояния, степени загрязнения необходимо провести отбор репрезентативных проб воды из исследуемого водоема. Под этим понимается их соответствие поставленной задаче по количеству, объему, выбранным точкам, времени отбора, а также по технике отбора, предварительной обработке, условиям хранения и транспортировки. Различают простые и смешанные (усредненные) пробы. Простые пробы, т.е. отобранные в полном объеме в определенный момент времени, характеризуют качество воды в данном пункте водоема во время отбора. Смешанные пробы представляют собой объединенную по тому или иному принципу серию простых проб. Смешанные пробы характеризуют среднее содержание определенных компонентов или свойств за некоторый промежуток времени или среднее значение для некоторого участка водоема. В зависимости от цели исследования отбор проб может быть разовым или регулярным. Место отбора выбирают в соответствии с целями анализа и на основании исследования местности.

Организация наблюдений за загрязнением атмосферы. Такие наблюдения проводятся на стационарных, маршрутных и передвижных (подфакельных) постах. Стационарные и маршрутные посты служат для проведения систематических наблюдений, передвижные — для разовых наблюдений в зонах непосредственного влияния промышленных предприятий. Наблюдения под факелами дымовых труб предприятий проводятся с целью получения материалов по распределению вредных веществ от отдельных источников выбросов в зависимости от метеоусловий и для получения оценки их влияния на загрязнение атмосферы.

Основные физиологические характеристики гомеостаза развития организма

Энергетическая стоимость физиологических процессов

Темп и ритмика ростовых процессов

Поведенческая активность

Энергетика физиологических процессов

Наиболее экономичный энергетический обмен имеет место лишь при оптимальных условиях среды

При оптимальных условиях организм находится на самом низком энергетическом уровне.

Количество энергии, необходимое организму в единицу времени для обеспечения физиологических процессов, есть интенсивность энергетического обмена.

При любых негативных изменениях среды обитания потребность в энергии будет увеличиваться

На реализацию одного и того же физиологического процесса в неблагоприятных условиях организму требуется больше энергии из-за необходимости компенсации негативного воздействий среды

До наступления необратимых изменений в организме неблагоприятное воздействие среды может быть скомпенсировано

Интоксикация или разложение загрязняющих веществ в биохимических реакциях

Выработка антител

Изменение метаболических путей в клетке

Энергетическая стоимость может расти до верхнего предела, определяемого максимальным уровнем энергетического обмена тест-объекта.

Биоэнергетический метод

преимущества

Позволяет определить оставшийся энергетический ресурс адаптации.

Предсказать пределы возможного ухудшения качества среды обитания.

Определить оптимальные условия существования конкретного вида животного для любого периода онтогенеза.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ КАЧЕСТВА ВОДЫ ПО ИЗМЕНЕНИЮ БИОМАССЫ ХЛОРЕЛЛЫ

Первичная биологическая продукция образуется в водоеме за счет процессов фотосинтеза, осуществляемого организмами, содержащими светопоглощающие пигменты и в первую очередь хлорофилл а.

Принцип метода основан на учете прироста биомассы одноклеточной водоросли хлореллы в тестированной воде по концентрации хлорофилла а.

Сhlа =11,9∙D665,

где Сhlа – концентрация хлорофилла, соответствующая длине волны 665 нм, [мкг/мл]; 11,9 — пересчетный коэффициент;

D665 — оптическая плотность, измеренная при 665 нм в кювете толщиной 1 см на ФЭК или спектрофотометре

Концентрация хлорофилла а соответствует

2,5% от веса сухой биомассы,

или 6,75% от содержания органического углерода.

Вс= 15·Сhlа ,

где Вс −биомасса фитопланктона в единицах углерода [мг/л];