Оценка качества водной среды по реакции избегания

Критерий оценки - временя нахождения планарии в «темном» и «светлом» поле экспериментального сосуда

Принцип метода оценки изменения регенерационной активности планарий

•Выборка планарий одного возраста, вида и места обитания

•Разделение планарий на четыре группы

•Проведение декапитации

•Облучение групп планарий гамма–квантами (или помещение в загрязненную воду)

Проведение компьютерной морфометрии (через 48 ч после воздействия)

Регенерация – одновременные процессы роста и морфогенеза – на уровне целого организма и клеточной пролиферации и дифференцировки – на тканевом и клеточном уровне

Критерий регенерации,

FR = s/S,

где s - площадь бластемы,

S - площадь всего тела планарии.

Hirudo medicinalis

У пиявок благодаря относительной дифференцировки мозга и морфологическим особенностям их мускулатуры (наличию кольцевых, продольных поперечных слоев) выявлены специфические симптомы отравлений при действии разнообразных токсических веществ.

Эта особенность пиявок применяется в лабораторных исследованиях качества очистки сточных вод.

Моллюски, мягкотелые (Mollusca) Unio, Anodonta

Нервная система у примитивных моллюсков состоит из окологлоточного нервного кольца и четырех продольных нервных стволов.

МЕТОД РЕГИСТРАЦИИ СМЫКАНИЯ-РАЗМЫКАНИЯ СТВОРОК РАКОВИН

Определение пороговых концентраций токсикантов в водных растворах, при которых периоды нахождения моллюсков с сомкнутыми раковинами увеличиваются, что, в конечном счете, ведет к гибели животных

Daphnia magna

Высокая степень цефализации По морфологической организации нервная система низших раков имеет признаки кольчатых червей, что отражается и в функциональных механизмах поведения.

• Четко выражена структурно-функциональная специализация мозга

Функциональные критерии дафний, характеризующие экотоксичность воды

Усиление или угнетение двигательной активности

•Выбросы эмбрионов

•Интенсивные выделения, которые коагулируют, и рачки вместе с эмбрионами и молодью путаются в нитках выделений

•Помутнение и изменение окраски, обесцвечивание

•Разложение жировых капель

•Неравномерное заполнение или пустой кишечник

•Судорожные конвульсии

•Замедление движения антенн

•Гибель рачков

Планарии

Есть небольшая группа высших организмов, которые являются классическими объектами современной биологии. В нее входят мыши, крысы, кролики, лягушки, рыбы, некоторые моллюски и насекомые. Такое положение дел удобно, поскольку давно проверенные модели позволяют дорисовывать здание научной картины мира, опираясь на полученные ранее сведения. Но, с другой стороны, каждая модель, т.е. каждый отдельно взятый биологический объект ограничен в своих18возможностях. Таким образом, биология крайне заинтересована в расширении числа базовых объектов. Однако этот процесс идет очень сложно − путем медленной «увязки» деталей функционирования разных физиологических механизмов в каждом конкретном случае с существующими «классическими» образцами.

Вышесказанное в полной мере относится к пресноводным плоским червям планариям, которые в течение последних ста лет проходят сложный путь вхождения в эту узкую группу животных. Планарии занимают в ней особое место, являясь классической моделью науки о морфогенезе и регенерации – восстановлении утраченных частей тела животного. Помимо планарий к экспериментальным моделям регенерации можно отнести восстановление конечностей у лягушек и высших позвоночных (собак и кроликов), регенерацию глаз у лягушек и хвоста у аксолотля или личинок амфибий. Крайне мало систем, на которых моделируется регенерация нервной системы. Сюда можно отнесли регенерацию отдельных ганглиев у некоторых аннелид и улиток. Однако только у планарий наблюдается регенерация их центральной нервной системы – головного ганглия, включая пролиферацию и дифференцировку нервных клеток, отрастание перерезанных нервных стволов и формирование новых глаз. Работа с планариям позволила уточнить и конкретизировать идею резервных (или стволовых) клеток в развитии и регенерации, сформулировать идею о нервной системе как основной структуре, регулирующей регенерацию. Поэтому Планарии по праву считаются классическим объектом науки о восстановлении органов и тканей животных – регенерации. Более полную информацию о планариям и их использовании в биологическом мониторинге можно найти в [4].

Планарии относят к отряду преветвистых пресноводных плоских червей − турбеллярий (тип Plaetelminthes, класс Turbellaria, отрядTriclada). Тип плоских червей представлен животными, через тело которых можно провести только одну плоскость симметрии. Впервые эволюции именно у этих животных появляется двусторонняя симметрия.19

Для экспериментов применяют Планарии Dugesia tigrina, культивируемые в оптимальных условиях климатостата и отобранные в равноценные экспериментальные группы по морфологическим параметрам тела. Каждая экспериментальная группа должна содержать не менее30ти животных. В учебных целях допустимо проводить эксперимента группах животных из пяти особей в каждой.

1. Отобрать 20 планарий после недельного голодания длиной 6 −6,5 мм. В опытах по регенерации целью предварительного отбора является сортировка животных для формирования равнозначных групп подопытных животных. Опыт показывает, что правильно подобранная экспериментальная группа животных позволяет снизить суммарную ошибку метода на 1,5 − 2%. По-видимому, морфогенез животных разных размеров протекает по-разному, что и приводит к увеличению разброса величины бластемы и росту суммарной ошибки метода. Непосредственная задача предварительного отбора − измерение макроморфологических (анатомических) параметров тела планарий в максимально стандартизированных условиях.

Основным и достаточным параметром при отборе животных является длина планарий. При определенном навыке работы с движущимися планариями можно достаточно точно измерить их длину с помощью окулярной линейки бинокулярного микроскопа. Для точного измерения длины планарий следует применить компьютерную систему для прижизненной морфометрии регенерации планарий.

2. Разделить четыре чашки Петри на «светлую» и «темную» зоны с помощью темной бумаги, которую наклеить на половину дна чашки с наружной стороны. Планарии предпочитают темную зону – это их экологическая ниша.

3. Подготовить растворы хлорида кадмия в водопроводной дехлорированной воде в концентрациях 0,05 мг/л (10 ПДК) – первая подгруппа; 0,005 мг/л (1,0 ПДК) – вторая подгруппа и 0,0005 мг/л (0,1ПДК) – третья подгруппа; четвертая группа является биологическим20контролем. В эту чашку Петри налить чистую культуральную воду. В чашки Петри налить по 20 мл готовых растворов.

4. Перенести по пять планарий с помощью пластиковых пипеток(или кисточки для красок) в каждую чашку Петри, начиная с контрольной и далее по градиенту увеличения концентрации вещества.

5. Сверху половину чашки Петри прикрыть бумагой и поставить под интенсивное освещение лампы дневного света. В течение 1 наблюдать двигательную активность планарий, фиксируя их расположение в экспериментальном поле.

Оптимальным инструментом для операций на планариях являются глазные скальпели. Их следует регулярно точить на алмазном камне исправить на кожаном ремне. Однако поскольку тело планарий покрыто эпителием, операции на них можно проводить любым стеклянным или металлическим ножом, обломком лезвия безопасной бритвы и т.д.21Единственным требованием является достаточно маленькая (не более2−3 см) режущая поверхность скальпеля или ножа.

Операции на планариях проводят в нестерильных условиях и без применения специальных анестетиков. Планарии очень подвижны, и практически невозможно полностью их обездвижить химическими препаратами. С другой стороны, помещение планарий в некий раствор для обездвижения неизбежно приведет к тому, что он попадет на раневую поверхность после операции. Это станет нежелательным артефактом, влияющим на регенерацию, и может особо негативно отразиться на ходе экспериментов с действием внешних химических стимуляторов морфогенеза.

Проверенным и эффективным естественным фактором торможения подвижности планарий является низкая температура [4]. Поэтому вроде случаев во время сложной операции (например, по удалению глотки) животных помещают на кусочек пищевого льда и далее через разрез на спинной поверхности тела проводят удаление глотки в течение 1 − 1,5 минут.

Перед операцией надо протереть спиртом операционную пластинку, шпатели, скальпели. При этом надо помнить, что спирт очень токсичен для планарий и следует оставить инструменты на воздухе, чтобы выветрились остатки спирта со стальных и стеклянных поверхностей. В ходе операции и во время экспериментов с регенерирующими животными нужно регулярно протирать все инструменты и операционную поверхность фильтровальной бумагой от слизи. Особо надо протирать приспособления для переноса планарий, на кончике которых всегда налипает слизь и частицы грязи из среды для культивирования, или регулярно менять одноразовые пластиковые пипетки. Для этого применяются маленькие бумажные тампоны, которые вставляются в кончик трубки пинцетом.

7. Декапитацию проводить под микроскопом МБС10 (бинокулярная лупа) с увеличением не более х2. Одним движением скальпеля сделать аккуратный срез в районе «глаз» планарий. После этого животных поместить в исследуемые растворы кадмия на четыре – пять дней для наблюдения за их регенерационной активностью. В этот пе22риод наблюдается фаза быстрого или линейного роста. Через указанный временной интервал образуется регенерационная почка (бластема), которая хорошо заметна благодаря ее светлой окрашенности в отличие от пигментированного тела всей Планарии.

Удалённые фрагменты и части тела планарий, оставшиеся после декапитации и эксперимента в контрольных образцах, собирают в отдельные сосуды и оставляют на два − три месяца. За это время они полностью завершают регенерацию, начинают активно кормиться. После подрастания до необходимых размеров данные животные могут быть вновь использованы для проведения экспериментов.

8. Провести оценку регенерационной активности планарий с помощью компьютерной программы обработки видеоизображения, например, ImegPro. Для этого планарий подоночное помещают в поле23зрения бинокуляра в чашках Петри диаметром 15 см или на предметное стекло в каплю воды.

Для освещения контуров тела Планарии применяют косое освещение снизу. Для этого перед началом регистрации следует подобрать угол наклона зеркала бинокуляра для получения наиболее подходящего изображения животного. Следует добиться положения осветительного прибора, при котором на темном фоне чашки Петри хорошо освещены контуры тела планарии.

После нескольких секунд адаптации планариям начинает равномерно и прямолинейно перемещаться (скользить) по дну чашки Петри. Оператор направляет животное к месту регистрации видеокамерой, медленно поворачивая чашку Петри с планарий. После того, как животное появляется в поле зрения микроскопа, начинается ее видео регистрация при нажатии компьютерной мышкой кнопки «Старт» на интерфейсе видеограббера.

В результате получается небольшой видеофильм (8 − 20 кадров), записанный в оперативной памяти видеограббера DigitEye15. После этого оператор выбирает оптимальный кадр и сохраняет его на жестком диске компьютера нажатием кнопки «Сохранить кадр» на интерфейсе видеограббера. При необходимости запись повторяется до получения изображения требуемого качества.

9. Провести анализ изображения контрольных и интактных планарий с помощью компьютерной программы. Для этого работу начать с открытия файла с изображением Планарии. Это происходит путем нажатия кнопки «Файл». При этом изображение Планарии выводится на экран интерфейса. Затем начинается обработка изображения. Вначале нажимается кнопка «Автоматического анализа изображения». Затем стрелка компьютерной «мышки» помещается на край изображения Планарии и нажимается левая кнопка мыши. Часто при автоматическом оконтуривании объекта программа обрисовывает его с видимыми ошибками. Оператор исправляет ошибки программы нажатием кнопки и отсекает ненужные части в «ручном» режиме. Следующая кнопка предназначена для отделения старых и новых частей тела24планарий. Это также делает оператор в соответствии с общими правилами определения границы старых и новых частей тела.

Далее программа ImegPro автоматически вычисляет основные морфологические параметры тела интактных планарий: длину, ширину и площадь головной части тела (от переднего конца тела до глаз), а также длину, ширину и площадь целого животного.

Затем определяют основные пропорции тела: длину и площадь каждого животного. Вычисляют отношение длины (и площади) головной части тела (бластемы) ко всей длине (и площади) тела планарии.

Следует отметить особое место морфогенеза в биологии планарий. В первую очередь, это касается способности планарий к регенерации.

Это свойство имеет очевидный приспособительный характер, поскольку у планарий нет внешнего или внутреннего скелета. Тело практически не защищено от механических травм, и способность к регенерации обеспечивает лучшие условия к выживанию. Однако помимо регенерации у планарий имеется еще минимум две системы жизнеобеспечения, непосредственно связанные с морфогенезом: бесполое размножение и пищеварение.

Планарии − гермафродитные животные. Большинство видов имеют мужские и женские гонады. Каждую весну они спариваются и откладывают коконы – небольшие (диаметром около 0,5 мм) круглые образования, из которых после завершения эмбрионального развития выплачиваются маленькие особи. Многие Планарии обладают также способностью к бесполому размножению – поперечному делению на две части: головную – материнскую и дочернюю – хвостовую. Далее головная особь отращивает себе новый хвост, а из небольшого хвостового фрагмента путем сложной перестройки формируется новое животное, обычно около 1 − 2 мм длиной, которое начинает самостоятельно питаться и расти. Механизм формирования нового хвоста у материнской особи и образование нового животного из хвостового фрагмента являются морфогенезом (или регенерацией), протекающим естественных условиях. Кроме того, необходимо отметить особую «морфогенетическую» особенность пищеварения планарий. После всасывания планарий пищи через мускулистую глотку происходит распад ее пищеварительной трубки на отдельные клетки, и все содержимое этой трубки становится доступным для остальных клеток тела Планарии. Они захватывают частицы пищи и переваривают ее. Этот26процесс называется фагоцитозом и является типичным случаем примитивной организации пищеварения у простых организмов. После завершения переваривания частиц пищи происходит процесс обратной сборки пищеварительной трубки и восстанавливается внутренняя структура организма планарий. Таким образом, пищеварение у планарий сопровождается и обеспечивается путем распада сборки пищеварительной трубки, т.е. фактически морфогенетическими механизмами.

Регенерация планарий является одним из классических объектов биологии развития. Этому способствовали

 легкость воспроизведения модели − практически в нестерильных условиях происходит регенерация любой части тела планарий;

 относительная быстрота восстановительного процесса − регенерация головного конца тела планарий с головным ганглием проходит в течение трех – пяти дней;

 простота регистрации самого процесса восстановления − естественным и хорошо различимым критерием завершенности регенерации служило появление новых глаз у регенератов

В пособии [4] описаны этапы становления метода оценки регенерационной активности планарий. Вначале регистрацию регенерации проводили фотографированием движущихся планарий регенератов через окуляр бинокулярного микроскопа. Далее проецировали негати28вы и проводили анализ изображений планарий путем измерения длины бластемы и всей Планарии. Во второй модификации метода для регистрации размеров тела планарий использовали дигитайзер – специальный электронный планшет, применяемый для переноса различных изображений (карт, схем, рисунков) в память компьютера. Таким образом, обводили и регистрировали все размерные параметры тела планарий (длину, ширину и площадь бластемы) и всей Планарии с помощью специального пакета программ на базе компьютера PDP11.

Основным недостатком метода прижизненной морфометрии была невозможность коррекции артефактов фотосъемки в ходе опыта. Основным отличием компьютерной морфометрии регенерации планарий от всех предыдущих является прямая прижизненная регистрация величины отрастающей части тела регенерантов – бластемы и разработка относительных количественных критериев – показателей динамики регенерации планарий.

Поэтому планарии по праву считаются классическим объектом изучения восстановления органов и тканей животных – регенерации.