СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ

СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ, ПРОТЕКАЮЩИЕ С УЧАСТИЕМ КОМПЛЕМЕНТА

РЕАКЦИЯ ГЕМОЛИЗА: литическое действие иммунной сыворотки в присутствии комплемента особенно четко проявляется в отношении эритроцитов. Если кролика иммунизировать эритроцитами барана, кроличья сыворотка приобретает специфическую гемолитическую активность, т.е. способность вызывать гемолиз эритроцитов, использованных для иммунизации. Этот эффект абсолютно зависим от иммунизации. Таким образом, наличие или отсутствие активного комплемента в гемолитической сыворотке очень четко выявляется по результатам ее взаимодействия с гомологичными эритроцитами: при наличии комплемента - гемолиз, образование «лаковой крови»; при его отсутствии - гемагглютинация, эритроциты выпадают на дно пробирки, образуя осадок в виде зонтика, жидкость бесцветна.

Приобретает ли  кроличья сыворотка гемолитическую активность, если проведена иммунизация эритроцитами барана?  Да  Нет

РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА

Преимущество РСК состоит в том, что природа антигена, участвующего в ней, не имеет значения, так как комплемент связывается с Fc - фрагментом любого антитела, относящегося к IgG и IgM, независимо от его антительной специфичности. РСК очень чувствительна: она позволяет обнаружить количество антител в 10 раз меньшее, чем в реакции преципитации. В основе РСК лежат два свойства комплемента:

1) способность связываться с комплексом антиген + антитело

2) вызывать лизис эритроцитов, использованных для получения гемолитической сыворотки.

РСК выполняется в две фазы при участии двух систем: бактериальной и гемолитической. В первой фазе (специфической) участвуют антиген+антитело+комплемент. Образовавшийся комплекс не визуализируется. Вторая фаза - выявление комплекса, образовавшегося при помощи индикаторной гемолитической системы (эритроциты барана+гемолитическая сыворотка). Гемолиз происходит в случае присоединения к гемолитической системе комплемента. Если же комплемент ранее адсорбировался на комплексе антиген+антитело в первой системе, то гемолиз эритроцитов не происходит, эритроциты выпадают в осадок.

При наличии в исследуемой сыворотке гомологичных антигену антител, образовавшийся комплекс (Аг+Ат) связывает на себе комплемент. При добавлении гемолитической системы гемолиза эритроцитов не происходит, так как комплемент связывается с комплексом Аг+Ат и эритроциты выпадают в осадок.

При отсутствии в исследуемой сыворотке специфических антител к антигену, введенному в первую систему, специфический комплекс антиген+антитело не образуется и комплемент остается в свободном состоянии. Поэтому при добавлении гемолитической системы к ней присоединяется комплемент. Результатом реакции в данном случае будет гемолиз эритроцитов - в пробирках появляется так называемая «лаковая» кровь.

Все компоненты, участвующие в реакции, должны быть предварительно оттитрованы и взяты в равных объемах.

РСК ставят в 5-и пробирках (1,2,3,4,5).

Исследуемую сыворотку (I) предварительно прогревают при 56°С в течение 30 минут для инактивации содержащегося в ней комплемента и пипеткой вносят по 0,5 мл в первую и пятую пробирки.

Второй пипеткой вносят 0,5 мл заведомо позитивной сыворотки (II) во вторую пробирку (контроль).

Третьей пипеткой вносят 0,5 мл заведомо негативной сыворотки (III) в 3-ю пробирку (контроль).

Четвертой пипеткой вносят по 0,5 мл физиологического раствора (IV) в четвёртую и пятую пробирки (контроль).

Этой же пипеткой вносят по 0,5 мл специфического антигена в рабочей дозе (V) в первую, вторую, третью, четвёртую пробирки. Пятой пипеткой вносят по 0,5 мл комплемента в рабочей дозе (VI) во все пробирки.

Отдельно готовят гемолитическую систему (VII) - смесь равных объемов 3% суспензии эритроцитов барана и гемолитической кроличьей сыворотки. Ингредиенты необходимо смешивать как можно быстрее. Причем гемолитическую сыворотку следует добавлять к суспензии эритроцитов, а не наоборот. Гемолитическую систему выдерживают 30 минут в термостате при 37°С и шестой пипеткой вносят по 1,0 мл в пробирки 1,2,3,4,5.

После добавления гемолитической системы пробирки помещают в термостат при 37°С до полного гемолиза в контрольных пробирках.

Результат реакции оценивают по четырёхплюсовой системе:

+ + + + - Отсутствие гемолиза

+ + + -    Гемолиз 25%

+ + -       Гемолиз 50%

+ -          Гемолиз 75%.

Для определения титра специфических антител исследуемую сыворотку (I) последовательно двукратно разводят физиологическим раствором.

Титром антител в исследуемой сыворотке считают наибольшее ее разведение, давшее задержку гемолиза.

Приобретает ли особое преимущество РСК, если природа антигена не имеет значения?  Да  Нет

РЕАКЦИЯ ПРЕЦИПИТАЦИИ И ЕЕ ВАРИАНТЫ

Качественная реакция кольцепреципитации применяется часто. Для ее постановки в тонкие преципитационные пробирки наливают сначала неразведенную преципитирующую сыворотку и сверху наслаивают раствор антигена. В случае гомологичности антител и антигена на границе между этими растворами через 3-10 минут появляется кольцо преципитата. 

Одним из наиболее эффективных методов анализа растворимых антигенов является реакция преципитации в геле. Она позволяет выявить число индивидуальных антигенов в исследуемой жидкости и провести анализ их антигенного родства. Разработан метод встречной иммунодиффузии, позволяющий проводить прямое сравнение различных антигенов и сывороток.

Этот метод часто применяют для определения токсигенности дифтерийных бактерий. Используют 1%-ный агар, приготовленный на физиологическом растворе, который разливают в чашки Петри слоем 0,5 см толщиной. После застывания в пластинке агара вырезают луночки: одну - в центре чашки, 4-5 - по окружности. В центральную луночку наливают преципитирующую сыворотку, а в периферический - раствор гомологичного и сравниваемых с ним антигенов. Учет результатов проводят через 24,48, и 72 часа инкубации при комнатной температуре. Антитела и антигены диффундируют навстречу друг другу, и в участках, где создаются их эквивалентные концентрации, образуются дугообразные полосы преципитации.

Постановка реакции термопреципитации  Асколи для выявления антигена возбудителя сибирской язвы

 Материал для исследования (I) измельчают, заливают десятикратным объемом физиологического раствора и кипятят в течение 15 минут (II). Полученный термоэкстракт фильтруют до полной прозрачности жидкости (III). Полученный фильтрат (IV) осторожно наслаивают пастеровской пипеткой (V) на внесенную предварительно в пробирку маленького диаметра сибиреязвенную преципитирующую сыворотку (VI). Если в исследуемом материале находится антиген возбудителя  сибирской язвы, то на границе контакта термоэкстракта и сибиреязвенной преципитирующей сыворотки через 2 минуты при комнатной температуре образуется тонкое мутно-белое кольцо преципитации (VII).

Во избежание ложноположительного результата реакции ставят контроли:

1.      преципитирующая сибиреязвенная сыворотка + стандартный специфический преципитиноген

2.      преципитирующая сибиреязвенная сыворотка + физиологический раствор

3.      нормальная лошадиная сыворотка + исследуемый термоэкстракт.

Первый контроль должен быть положительным, остальные - отрицательными.

Позволяет ли выявить число индивидуальных антигенов в исследуемой жидкости реакция преципитации в геле?  Да  Нет