КонюховХроматография

176	В. Ю. КОНЮХОВ. ХРОМАТОГРАФИЯ

Рис. 61

Пример калибровочной кривой в ГПХ

равным объему подвижной фазы Vм. Коэффициент распре* деления для этих молекул равен нулю.

Графическую зависимость между удерживаемым объ* емом VR и молярной массой (или размером молекул) ана* лизируемых веществ называют частной калибровочной кривой. Каждый сорбент характеризуется своей калибро* вочной кривой, по которой оценивают область разделяе* мых на нем молярных масс (рис. 61). Точка А соответству* ет пределу эксклюзии, или мертвому объему колонки Vм. Все молекулы, масса которых больше, чем в точке А, будут элюироваться одним пиком с удерживаемым объемом Vм. Точка В отражает предел проникания, и все молекулы, мас* са которых меньше, чем в точке В, также будут выходить из колонки одним пиком с удерживаемым объемом Vt.

Между точками А и В располагается диапазон селектив/ ного разделения. Соответствующий ему объем Vi = Vt – Vм

ГЛАВА 3. ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

177

называют рабочим объемом колонки. Линейный участок (рис. 61) частной калибровочной кривой (отрезок CD) опи* сывается уравнением:

VR = C1 – C2 lnM,

где C1 — отрезок, отсекаемый на оси ординат продолже* нием отрезка CD; С2 — тангенс угла наклона этого отрез* ка к оси ординат. Величину С2 называют разделительной емкостью колонки и выражают ее через объем (в см3) рас* творителя, приходящийся на один порядок изменения мо* лярной массы. Чем больше разделительная емкость, тем лучше разделение в данном диапазоне масс. В нелиней* ных областях калибровочной кривой (участки АС и BD) из*за уменьшения С2 эффективность фракционирования заметно снижается. Кроме того, нелинейная связь между lnM и VR существенно усложняет обработку данных и сни* жает точность результатов. Поэтому следует стремиться выбрать колонку (или набор колонок) так, чтобы разделе* ние анализируемого полимера происходило в пределах линейного участка калибровочной кривой.

Если какое*либо вещество элюируется с удерживаемым объемом больше чем Vt, то это указывает на проявление других механизмов разделения (чаще всего адсорбционно* го). Адсорбционные эффекты обычно проявляются на же* стких гелях (не набухающих), но иногда наблюдаются и на полужестких гелях из*за повышенного сродства к матри* це геля. Примером может служить адсорбция ароматиче* ских соединений на стиролдивинилбензольных гелях.

Обычно в эксклюзионной хроматографии стремятся полностью подавить адсорбционные и другие побочные эф* фекты, так как они, особенно при исследовании молярно* массового распределения (ММР) полимеров, могут суще* ственно искажать результаты анализа.

Принципиальными отличиями эксклюзионной хрома* тографии от других вариантов являются заранее извест* ная продолжительность анализа в каждой конкретной сис* теме, возможность предсказания порядка элюирования компонентов по размеру их молекул, примерно одинаковая ширина пиков во всем диапазоне селективного разделения

178	В. Ю. КОНЮХОВ. ХРОМАТОГРАФИЯ

и уверенность в выходе всех компонентов пробы за доста* точно короткий промежуток времени, соответствующий

объему Vt.

Данный метод применяют преимущественно для ис* следования ММР полимеров и анализа макромолекул био* логического происхождения (белки, нуклеиновые кисло* ты и т. д.), но указанные особенности делают его чрезвы* чайно перспективным для анализа низкомолекулярных примесей в полимерах и предварительного разделения проб неизвестного состава. Получаемая при этом инфор* мация существенно облегчает выбор наилучшего варианта для анализа данной пробы. Кроме того, микропрепаратив* ное эксклюзионное разделение часто используют в качест* ве первого этапа при разделении сложных смесей путем комбинации различных видов ВЭЖХ.

В эксклюзионной хроматографии предъявляются же* сткие требования к стабильности потока подвижной фазы и постоянству температуры. При изменении Т на 10 С ошибка определения средних молярных масс превышает10%. Поэтому в данном случае обязательно термостати* рование разделительной системы. Как правило, достаточ* на точность поддержания температуры в пределах до 80– 100 С ( 1 С). В некоторых случаях, например при анали* зе полиэтилена и полипропилена, рабочая температура составляет 135–150 С.

Наиболее часто в эксклюзионной хроматографии по* лимеров в качестве детектора применяют дифференциаль* ный рефрактометр.

Выбор сорбентов, обеспечивающих оптимальные усло* вия для решения конкретной аналитической задачи, обыч* но проводят в несколько этапов. Матрица геля должна быть химически инертной, т. е. она не должна химически связывать разделяемые макромолекулы. При анализе бел* ков, ферментов, нуклеиновых кислот не должна происхо* дить их денатурация при контакте с матрицей.

Первоначально на основании данных о химическом со* ставе и растворимости анализируемых веществ устанав* ливают, какой вариант анализа следует применить — хро* матографию в водных системах или в органических рас*

ГЛАВА 3. ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

179

творителях. От этого зависит выбор сорбента. Разделение веществ низкой и средней полярности в органических рас* творителях можно успешно осуществить как на полуже* стких, так и на жестких гелях. Исследование ММР гидро* фобных полимеров, содержащих полярные группы, чаще проводят на колоннах со стиролдивинилбензольными ге* лями, так как в этом случае практически не проявляются адсорбционные эффекты и не требуется добавка модифи* каторов к подвижной фазе, что значительно упрощает под* готовку и регенерацию растворителя.

Для работы в водных системах используют главным образом жесткие гели (сорбенты); иногда удается хрома* тографировать и на специальных полужестких гелях.

Далее по калибровочным кривым или данным о диа* пазоне фракционирования, выбирают сорбент нужной по* ристости с учетом имеющихся сведений о молярной массе анализируемых веществ. Если в анализируемой смеси ве* щества отличаются по молярной массе не более чем на 2– 2,5 порядка, то обычно удается разделить их на колонках с одним размером пор. При более широком ММР следует использовать последовательно соединенные колонки с сор* бентами различной пористости. Калибровочную зависи* мость в этом случае получают сложением кривых для от* дельных сорбентов.

Растворители, применяемые в эксклюзионной хрома* тографии, должны удовлетворять следующим основным требованиям:

полностью растворять анализируемые вещества при температуре разделения;

смачивать поверхность сорбента и не ухудшать эффек* тивность колонки;

предотвращать адсорбцию (и другие взаимодействия) разделяемых веществ с поверхностью сорбента;

обеспечивать максимально высокую чувствительность детектирования;

иметь низкую вязкость и токсичность.

Кроме того, при анализе полимеров имеет существенное значение термодинамическое качество растворителя: весь* ма желательно, чтобы он был «хорошим» по отношению

180	В. Ю. КОНЮХОВ. ХРОМАТОГРАФИЯ

к разделяемому полимеру и матрице геля, т. е. в нем были бы максимально выражены концентрационные эффекты.

Растворимость образца обычно является главным ли* митирующим фактором, ограничивающим ассортимент пригодных подвижных фаз. Наилучшим органическим растворителем для эксклюзионной хроматографии синте* тических полимеров по комплексу свойств является ТГФ. Он обладает уникальной растворяющей способностью, низкой вязкостью и токсичностью, лучше многих других растворителей совместим со стирол*дивинил*бензольны* ми гелями и, как правило, обеспечивает высокую чувст* вительность детектирования при использовании рефрак* тометра или УФ*детектора в области до 220 нм.

Для анализа высокополярных и нерастворимых в тет* рагидрофуране полимеров (полиамиды, полиакрилонит* рил, полиэтилентерефталат, полиуретаны и др.) обычно используют диметилформамид или крезол, а разделение полимеров низкой полярности, например различных кау* чуков и полисилоксанов, часто проводят в толуоле или хлороформе. Последний является также одним из лучших растворителей при работе с ИК*детектором.

Для высокотемпературной хроматографии полиоле* финов применяют о*дихлорбензол и 1,2,4*трихлорбен* зол обычно при 135 С, при более низких температурах они слабо растворяют полиолефины. Эти растворители имеют высокий показатель преломления, поэтому иногда их це* лесообразно использовать вместо тетрагидрофурана для анализа полимеров с низким коэффициентом преломле* ния, что позволяет повысить чувствительность рефракто* метра.

Для предотвращения окисления растворителей и по* лужестких гелей в условиях высокотемпературной экс* клюзионной хроматографии к дихлорбензолу и 1,2,4*три* хлорбензолу добавляют антиокислители (ионол, санто* нокс R и др.).

Жесткие гели совместимы с любыми подвижными фа* зами, имеющими рН < 8–8,5. При более высоких значе* ниях рН силикагель начинает растворяться и колонка не* обратимо теряет эффективность. Стиролдивинилбензоль*

ГЛАВА 3. ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

181

ные гели совместимы в основном с элюентами умеренной полярности. Для работы на колонках с *стирогелем (от 1000 Å и выше) пригодны тетрагидрофуран, ароматиче* ские и хлорированные углеводороды, гексан, циклогек* сан, диоксан, трифторэтанол, гексафторпропанол и диме* тилформамид.

Степень набухания частиц геля в различных раство* рителях неодинакова, поэтому замена элюента в колон* ках с данными сорбентами может привести к снижению эффективности за счет изменения объема геля и образова* ния пустот. При использовании неподходящих раствори* телей (ацетон, спирты) может происходить столь сильная усадка геля, что колонка оказывается испорченной. У сор* бентов с малым размером пор (типа *стирогеля 100Е и 500Е) такая усадка наблюдается как в полярных, так и в неполярных растворителях, поэтому с ними нельзя рабо* тать в насыщенных углеводородах, фторированных спир* тах и диметилформамиде. Удобным, хотя и дорогим вы* ходом из положения является использование отдельных наборов колонок для каждого применяемого растворите* ля. Некоторые фирмы с этой целью выпускают колонки с одним и тем же размером пор, заполненные разными рас* творителями — тетрагидрофураном, толуолом, хлорофор* мом и ДМФА.

При разделении макромолекул основной вклад в раз* мывание полосы вносит медленный массообмен, ему спо* собствует высокая вязкость применяемых растворителей. Для снижения вязкости (а также для улучшения раство* римости) эксклюзионную хроматографию часто проводят при повышенных температурах, что существенно улучша* ет эффективность фазы.

Анализ большинства полимеров на жестких гелях час* то осложняется их адсорбцией. Для подавления адсорб* ции обычно используют растворители, которые адсорби* руются на поверхности геля сильнее, чем анализируемые вещества. Если по каким*либо причинам это невозмож* но, то подвижную фазу модифицируют добавкой 0,1–2% полярного вещества, например тетрагидрофурана. Зна* чительно более сильными модификаторами являются

Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)

182	В. Ю. КОНЮХОВ. ХРОМАТОГРАФИЯ

этиленгликоль и полигликоли с различной молярной мас* сой (ПЭГ*200, ПЭГ*400, карбовакс 20 М). Иногда при ана* лизе поликислот в диметилформамиде добавляют сильные кислоты. Следует отметить, что полностью устранить ад* сорбцию добавкой модификаторов удается не всегда. В та* ких случаях используют полужесткие гели.

Некоторые полимеры хорошо растворяются только в высоко полярных растворителях (ацетон, диметилсуль* фоксид и т. п.), несовместимых со стиролдивинилбензоль* ными гелями. При их разделении на жестких сорбентах выбор растворителя проводят в соответствии с общими принципами, изложенными выше.

Свои характерные особенности имеет эксклюзионная хроматография в водных средах. Из*за специфики мно* гих разделяемых систем (белки, ферменты, полисахари* ды, полиэлектролиты и др.) и разнообразия применяемых сорбентов существует очень много вариаций состава ПФ для подавления различных нежелательных эффектов. В качестве сорбентов применяют декстрановые гели (се* фадексы), полиакриламидные, оксиакрилметакрилатные гели, гели агарозы и др.

В процессе эксклюзионного хроматографирования по* ведение макромолекул определяется в первую очередь их гидродинамическими размерами. Характерной особенно* стью белков, ферментов и синтетических полиэлектроли* тов является зависимость размеров их макромолекул от рН и ионной силы раствора. С уменьшением рН и ионной силы раствора макромолекулы принимают раскрученные конформации, имеет место так называемое полиэлектро* литное набухание. Среднестатистические размеры клуб* ков макромолекул при этом увеличиваются, что приво* дит в итоге к снижению объемов удерживания указанных ВМС в режиме эксклюзионной хроматографии.

Общими приемами модификации является добавка раз* личных солей и применение буферных растворов с опреде* ленным значением рН. В частности, поддержание рН < 4 дает возможность подавить слабую ионообменную актив* ность силикагелей, обусловленную присутствием на их по* верхности кислых силанольных групп. Требуемая ионная

ГЛАВА 3. ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

183

сила подвижной фазы достигается при концентрации бу* ферного раствора 0,05–0,6 моль/дм3, оптимальную кон* центрацию подбирают экспериментально.

Для предотвращения ионообменной сорбции катион* ных соединений часто используют такой активный моди* фикатор, как тетраметиламмонийфосфат при рН = 3. Од* нако при разделении некоторых белков могут проявляться гидрофобные взаимодействия, снижающие селективность фазы. Те же эффекты иногда проявляются и при работе с дезактивированными гидрофильными сорбентами. Для их устранения к растворителю добавляют метанол. Иногда в водную подвижную фазу вводят полярные органические растворители, полигликоли, кислоты, основания и по* верхностно*активные вещества.

3.1.4. АФФИННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Основы аффинной хроматографии были разработаны в конце 1960*х годов. Аффинная хроматография (от лат. affinis — родственный) — биоспецифическая хроматогра* фия, хроматография по сродству. Это метод очистки и раз* деления белков (рис. 62), основанный на их избирательном

Рис. 62

Принцип разделения пробы в аффинной хроматографии:

1 — лиганды; 2, 3 — молекулы разделяемых белков.

Прикрепление белка

Рис. 63

184	В. Ю. КОНЮХОВ. ХРОМАТОГРАФИЯ

взаимодействии с лигандами, ковалентно связанными с инертным носителем — неподвижной фазой. Применяет* ся преимущественно для разделения ферментов.

Обычно в качестве лигандов используют соединения, взаимодействие которых с разделяемыми веществами ос* новано на биологической функции последних. Так, при разделении ферментов лигандами служат их субстраты, ингибиторы или коферменты.

Высокая эффективность аффинной хроматографии обу* словлена тем обстоятельством, что разделение основано на специфических функциональных свойствах, отличающих данный фермент от множества других биополимеров, а не на различии физико*химических свойств молекул (заря* да, формы и размера).

Помимо ферментов, методом аффинной хроматогра* фии можно выделять также токсины, рецепторы, инги* биторы, транспортные белки и другие биологически ак* тивные вещества. Высокой избирательностью отличается так называемая иммуносорбция, при которой в качестве лиганда используют антитела, обладающие специфично* стью к выделяемым белкам; особенно эффективны моно* клональные антитела.

Неподвижная фаза в аффинной хроматографии пред* ставляет собой специально получаемый сорбент, постро* енный обычно по схеме: носитель — соединяющее звено («ножка») — специфический лиганд (рис. 63). В качестве носителя чаще всего приме* няют сефароза*производное агарозы, имеющее сетчатое строение. Перед присоедине* нием к ней лиганда, или «нож* ки», содержащих, как пра* вило, аминогруппу, сефаро*

сгистидиновой зацепкой зу активируют бромцианом:

кгрануле в аффинной колонке

ГЛАВА 3. ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

185

Концентрацию лиганда поддерживают в пределах 0,1– 10 мкмоль на 1 г влажного сорбента.

Сефароза, однако, легко разрушается под действием ряда химических веществ и микроорганизмов. Более ста* бильны макропористые неорганические носители (крем* незем, стекло) и органические полимеры.

В качестве «ножки» используют обычно ди* и поли* амины, *аминокислоты, пептиды, олигосахариды. «Нож* ка» отдаляет лиганд от носителя и тем самым устраняет стерические препятствия, возникающие при взаимодей* ствии лиганда с выделяемым веществом. Как и носитель, она должна быть инертной и не влиять на процессы, про* исходящие в процессе хроматографирования, что не все* гда удается. Например, присоединение «ножки» по при* веденной выше реакции приводит к образованию катион* ной группировки изомочевины, и сорбент приобретает свойства анионита.

Лигандами могут служить субстраты (например, крах* мал или гликоген при разделении амилаз), однако их пре* вращение в ходе хроматографирования, катализируемое разделяемым ферментом, постоянно изменяет свойства сорбента. Поэтому, как правило, применяют аналоги суб* стратов, устойчивые к дальнейшему превращению, т. е. ингибиторы ферментов. Так, для выделения протеиназ ис* пользуют нерасщепляемые ими пептиды D*аминокислот. Эффективны природные ингибиторы ферментов, напри* мер, пепстатин — ингибитор аспартильных протеиназ. Иногда применяют лиганды, связывающие большие груп* пы родственных ферментов (в частности, киназы и дегид* рогеназы). Примеры таких «группоспецифических» ли* гандов — антрахиноновые красители, аналоги никотина* мидадениндину*клеотида.

Известны лиганды (например, производные фенилбор* ной кислоты), имитирующие при взаимодействии с фер* ментом структуру переходного комплекса с субстратом. Такие лиганды эффективны при выделении сериновых гидролаз.

Разделение в аффинной хроматографии обычно прово* дят на хроматографических колонках; иногда разделяемую