РАЗОБРАННЫЕ БИЛЕТЫ

10.Позволяет решать аналитические задачи (разделение, идентификация, определение) и препаративные (очистка, выделение, концентрирование). Все это можно делать в режиме реального времени.

Процесс: Сначала идет культивирование целевого белка в клетках. После этого клетки разрушаются (например, ультразвуком) и полученная масса центрифугируется. Полученный супернатант подвергают очистке. Белки предварительно могут денатурировать, чтобы они не различались по форме. Тип хроматографии выбирается на основе белка.

Кратко очистка проходит в 4 стадии:

1)посадка белка

2)смыв с колонки всего, что не связалось с ней,

3)элюирование белка

4)отмывка с колонки всего, что не элюировалось в зоне белка.

На всех этапах собирают фракции для анализа на содержание белка. Затем проводят электрофорез, для выявления чистоты фракций. Если степень чистоты не удовлетворяет, проводят ионообменную хроматографию.

Принцип ионообменной: ионообменная хроматография позволяет разделить молекулы, основываясь на ионных взаимодействиях. Неподвижная фаза имеет заряженные функциональные группы, которые взаимодействуют с анализируемыми ионизированными молекулами противоположного заряда. Этот вариант хроматографии классифицируется на два типа — катионную и анионную ионообменную хроматографию. Суть в том, что только положительно заряженные белки проходят сквозь колонку, а остальные остаются в ней. При изменении pH среды меняются заряды, и исходя из заряда выходят разные белки в зависимости от их суммарного заряда (аминокислотного).

Билет 29.

1. Редактирование геномов. Возможности и перспективы его использования. Редактирование генома – один из видов генной инженерии, в котором может быть

проведено включение, удаление или перемещение фрагментов ДНК в геноме организма, с использованием специфически спроектированных эндонуклеаз, или «молекулярных ножниц». Эти нуклеазы создают сайт-специфичные двухцепочечные разрывы в ДНК в определённом участке генома. Индуцированные двухцепочечные разрывы репарируются в процессе рекомбинации, что позволяет получать направленные мутации.

Вэтом методе используются 4 типа нуклеаз.

•Мегануклеазы – характеризуются большим сайтом узнавания (двухцепочечные последовательности ДНК от 12 до 40 пар оснований). В природе очень много их

– вероятность обнаружения мегануклеазы, способной разрезать данный ген в желаемом месте, чрезвычайно мала.

•Нуклеазы с цинковыми пальцами – это небольшие структурные мотивы белка, стабилизированный одним или двумя ионами цинка, Цинковые пальцы являются белковыми модулями, взаимодействующими с ДНК, РНК, другими белками или небольшими молекулами. Основными группами белков с цинковыми пальцами являются ДНК-связывающие факторы транскрипции, а также искусственные ферменты рестрикции, получаемые слиянием ДНК-связывающего домена цинкового пальца с ДНК-разрезающим доменом нуклеазы. Домен цинкового пальца может быть спроектирован так, чтобы узнавать желаемую последовательность ДНК и связываться с ней.

•нуклеазы TALEN – похожий механизм на предыдущий.

•система CRISPR-Cas – двухкомпонентная систему, состоящая из направляющей РНК и нуклеазы Cas9. Нуклеаза Cas9 разрезает ДНК в пределах ~ 20

нуклеотидных областей, определенных направляющей РНК

Перспективы:

1.«CRISPR — для исследований». Технология позволяет изучать роль конкретных генов в процессах развития и жизнедеятельности организмов.

2.CRISPR — для биотехнологий». Здесь речь идет о применении CRISPR-Cas9 как минимум для трех целей:

•для улучшения свойств сельскохозяйственных животных и растений.

•для контроля распространения инфекций, переносимых животными

•для конструирования новых метаболических путей и осуществления направленной эволюции биомолекул.

3.«CRISPR — для терапии». CRISPR-Cas9 в культурах клеток или животных моделях уже «примерили» для серповидноклеточной анемии и β-талассемии, миодистрофии Дюшенна, муковисцидоза катаракты.

2. Молекулярная филогенетика. Молекулярные часы эволюции и филогенетические дистанции между организмами.

Молекулярная филогенетика — способ установления родственных связей между живыми организмами на основании изучения структуры полимерных макромолекул

— ДНК, РНК и белков. Результатом молекулярно-филогенетического анализа является построение филогенетического дерева живых организмов.

Методы:

1.Метод матрицы расстояний. Его основа — расчет попарных различий между соответствующими генами всех видов, участвующих в таком анализе. Делается это следующим образом: гены каждого анализируемого вида сравниваются по каждой позиции нуклеотидов, и чем больше найдено отличий, тем больше будет «расстояние» между видами. Каждая ветвь определяется числом нуклеотидных замен, и число замен между двумя точками на дереве равно сумме замен вветвях, соединяющих эти точки. Затем строится матрица, в которую заносится это значение для каждой возможной пары сравниваемых генов. Далее матрица расстояний является входной информацией для алгоритмов построения деревьев.

2.Самый популярный среди подобных алгоритмов — это метод ближайших соседей. Среди анализируемых видов находят два с минимальными различиями в последовательности (т.е., максимально похожие). Исходя из составленной матрицы, данные об этих видах «объединяются», и далее они участвуют в анализе в объединенном состоянии. Виды один за другим проходят эту процедуру до тех пор, пока не будет найдено одно, полностью разрешенное дерево. Этот алгоритм хорош тем, что он относительно прост и подходит для

обработки больших наборов данных.

Генетическое расстояние (дистанция) — мера генетического различия

(дивергенции) между видами, подвидами, или популяциями одного вида. Малое генетическое расстояние означает генетическое сходство, большее генетическое расстояние означает меньшее генетическое сходство. Существует много параметров, используемых для измерения генетического расстояния. В простейшем случае генетическое расстояние между двумя популяциями одного вида может быть определено как разница в частотах определенного признака.

Молекулярные часы эволюции — метод датирования филогенетических событий (расхождений видов или других таксонов), основанный на гипотезе, согласно которой эволюционно значимые замены мономеров в биомолекулах происходят с практически постоянной скоростью. Обычно для подобных вычислений используются нуклеотидные последовательности ДНК и аминокислотные последовательности белков. Скорость мутаций может быть неравномерной и различается для разных видов, из-за чего метод дает лишь приблизительные результаты.

Молекулярные часы: в гомологичных генах разных организмов количество нуклеотидных различий пропорционально времени их расхождения от общего предка. Зная количество нуклеотидных различий, можно вычислить время возникновения таксона.

Пример: Как определялось время расхождения таксонов? Зная время расхождения однодольных и двудольных растений (125 млн. лет) и время расхождения хордовых и ближайших к ним беспозвоночных (около 680 млн. лет) и количество различий в тРНК между членами этих пар, рассчитывалась скорость замен в тРНК хлоропластов и тРНК эукариот. Предполагая близкую скорость молекулярной эволюции у их предков, авторы работы определяют время для каждой точки ветвления.

Билет 30.

1.Стратегия секвенирования геномов de novo. Генетическое и физическое картирование геномов. Физические карты высокого и низкого разрешения.

Секвенирование de novo – сбор генома без использования референсного генома.

1)Фрагментация ДНК. Анализируемая ДНК выделяется, фрагментируется и клонируется в векторы. Векторы затем вводятся в трансформированные бактерии, изолируется векторная ДНК. Полученные векторные геномы секвенируют, получают контиги (набор перекрывающихся коротких фрагментов ДНК), после чего выравнивают относительно друг друга, получая длинный сиквенс анализируемой ДНК (скаффолд – «ДНК-скелет» из контигов с промежутками известной длины).

2)Создание библиотеки генов – набора ДНК всего генома одного организма. Для построения геномной библиотеки ДНК экстрагируют из клеток и затем расщепляют рестриктазой, чтобы разрезать ДНК на фрагменты определённого размера. Фрагменты затем встраивают в вектор с помощью фермента ДНК-лигазы. Далее вектор ДНК может быть встроен в организм-хозяин — обычно в популяцию кишечной палочки (E. coli) или дрожжей, где в каждой клетке содержатся копии вектора с одной, уникальной вставкой.

3)Анализ больших фрагментов ДНК рестрикционным картированием. Это техника определения положения определенной нуклеотидной последовательности (чаще всего гена) на генетической (физической) карте с помощью рестриктаз типа 2 в линейном масштабе. Рестрицированные фрагменты анализируемой нуклеотидной последовательности электрофоретически разделяют по размерам, затем их размеры сопоставляют и оценивают расстояние между разными сайтами рестрикции.

Рестрикционная карта — вид физической карты, на которой указан порядок следования и расстояния между сайтами расщепления ДНК-рестриктазами (обычно участок узнавания рестриктазы размером 4—6 п. н.). Маркерами этой карты являются рестрикционные фрагменты (сайты рестрикции).

4) Прогулки по хромосоме (направленное секвенирование) – метод анализа протяженных нуклеотидных последовательностей вокруг секвенированных участков генома с использованием «блуждающих» праймеров, который заключается в последовательном отборе клонов, содержащих частично перекрывающиеся фрагменты ДНК из определенного района генома.

Общий процесс выглядит следующим образом:

•Праймер, который соответствует началу ДНК, которая планируется быть отсеквенирована, используется для синтеза короткой цепи ДНК, прилегающей к неизвестной последовательности, начиная с праймером (см ПЦРА ).

•Новая короткая цепь ДНК секвенируется с использованием метода терминации цепи.

•Конец секвенированной цепи используется в качестве праймера для следующей части длинной последовательности ДНК, отсюда и термин «ходьба».

Этот метод можно использовать для секвенирования целых хромосом (отсюда «ходьба по хромосомам»).

5) Рэндом-секвенирование или шотган-метод. Сперва клонируют анализируемую ДНК, после чего они разрезаются на части разной длины, и компьютеризировано выравниваются относительно друг друга. В результате получают перекрывающиеся фрагменты сиквенса (чем больше перекрытие, тем качественнее), и по этим перекрытиям составляют буквенную последовательность.

Карта генома – это графическая схема, позволяющая исследователям ориентироваться в геноме, искать в нем места, которые могут быть важны и интересны. В простейшем виде карта генома представляет собой линию, по всей длине которой расположены различные ориентиры, помеченные буквами и цифрами, дающие возможность исследователю идентифицировать отдельные признаки. Карта не одно и то же, что и последовательность оснований генома. Расположение генов на карте можно вычислить без определения последовательности оснований.

Как проводится построение генетические карты? Нужно выяснить расположение определенного гена, вызывающего заболевание, которое выражается определенными фенотипическими признаками. Обследуются семьи, члены которых страдают этим заболеванием, чтобы узнать, с какими другими генетическими признаками связана эта болезнь. Гены любых признаков, имеющих тенденцию наследоваться вместе с предрасположенностью к болезни, с большой долей вероятности могут быть локализованы на одной хромосоме рядом с генами, вызывающими болезнь. Их выбирают в качестве маркеров для искомого гена. Определив несколько маркеров с известным расположением на хромосоме, можно с большой точностью (до нескольких миллионов п.о.) установить расположение гена, вызывающего болезнь. Затем исследования фокусируются на части генома, несущей указанный ген, и поисках гена, который имеет различную последовательность оснований у здоровых и больных людей, или гена, функции которого могут быть связаны с болезнью. Существует два типа генетических карт – карты генетического сцепления и физические карты.

Основываясь на явлениях сцепления генов и кроссинговера можно построить генетические карты хромосом — схемы взаимного расположения структурных

генов, регуляторных элементов и генетических маркеров, а также относительных расстояний между ними на хромосоме (группе сцепления).

Генетическое картирование – это способ точно определить, какая хромосома имеет какой ген, и точно определить, где этот ген находится на этой конкретной хромосоме. Картирование также действует как метод определения того, какой ген, скорее всего, рекомбинирует, исходя из расстояния между двумя генами. Единицей измерения здесь служат сантиморганы – проценты рекомбинации. Чем дальше друг от друга находятся два гена, тем больше вероятность их рекомбинации. Если бы он был ближе, произошло бы обратное.

Физическое картирование – группа методов, позволяющих строить карты генома высокого уровня разрешения и определять расстояния между локализуемыми нуклеотидными последовательностями с точностью до нескольких десятков тысяч п.н. до одной нуклеотидной пары.

В отличие от генетических карт, построенных на освное групп сцепления и дающих статистические расстояния между ДНК-маркерами и генами, физическое картирование позволяет определять физические расстояния между маркерами в каждой хромосоме. Оно основано на построении физических карт, т.е. определении порядка расположения физических маркеров вдоль молекулы ДНК. В качестве физических маркеров могут выступать сами гены, анонимные фрагменты ДНК, точки расщепления ДНК рестриктазами.

Исчерпывающая физическая карта генома человека максимального разрешения будет содержать полную нуклеотидную последовательность всех его хромосом. На другом полюсе физических карт с минимальным разрешением находятся хромосомные (цитогенетические) карты генома.

Возможность картирования основана на теоретическом постоянстве процента кроссинговера между определёнными генами. Однако при таком методе генетического картирования физическое расстояние между генами нередко отличается от их генетического расстояния, так как кроссинговер происходит не с одинаковой вероятностью в разных участках хромосом.

2.Полиморфизм белков в клетке, его источники. Ортологичные и паралогичные белки.

Уразных особей возникают варианты (мутации) разных генов или варианты одного и того же гена. Варианты генов, образующиеся у отдельных особей, могут постепенно распростра­няться в популяции в результате наследования, если они не детальны.

Как следствие генотипической гетерогенности полиморфизм белков — существование разных форм белка, выполняющего одинаковые или очень сходные

функции (изобелки). Чаще всего изучают полиморфизм ферментов (т. е. наличие изоферментов), поскольку их гораздо легче обнаружить, чем другие белки, по катализируемой ими реакции.

Источники полиморфизма:

Различают 2 вида полиморфизма:

•Наследственный полиморфизм создаётся мутациями и комбинативной изменчивостью.

•Адаптационный полиморфизм обусловлен тем, что естественный отбор благоприятствует разным генотипам из-за разнообразия условий среды в пределах ареала вида или сезонной смены условий.

Трансплантационная несовместимость. От полиморфизма белков в сочетании с иммунологическими реакциями зависит трансплантационная несовместимость. Клетки трансплантата содержат аллельные варианты белков, отличающиеся от вариантов реципиента. Эти белки донора являются антигенами для организма реципиента и приводят к развитию реакции клеточного иммунитета, в результате которой трансплан­тированная ткань отторгается.

Отторжение трансплантата в наибольшей мере определяется главным комплексом тканевой совместимости — так называют участок генома, содержащий небольшое число структурных генов (не меньше трех), и белки, кодируемые этими генами. Гены главного комплекса тканевой совместимости отличаются необычайно высоким полиморфизмом: число комбинаций разных аллелей по генам этой системы дости­гает нескольких миллионов. Это самая полиморфная система человека из всех известных в настоящее время. Высокая степень полиморфизма генов обеспечивает столь же высокую степень ин­дивидуальности по белкам, которые кодируются этими генами. Подбор донора и реципиента, сходных по антигенным свойствам белков главного комплекса совместимости, значительно повыша­ет вероятность приживления трансплантата.

Полиморфизм белков был первым поколением маркеров, используемых для генетических исследований домашних животных. Однако количество полиморфных локусов, доступных для анализа, и уровень их наблюдаемого полиморфизма часто низки, что сильно ограничивает их применение в исследованиях генетического разнообразия.

Белки ортологи – это гомологичные белки разных организмов, разошедшиеся в процессе видообразования и обычно выполняющие одну и ту же функцию

Парологи – гомологичные белки одного организма, возникающие в результате дупликации гена и могут разойтись в процессе эволюции так, что начнут выполнять различные функции.

Термины и базы:

Рестрикция — разрез цепочки ДНК, осуществляемый специальным ферментом (рестриктазой)

Геномика — раздел молекулярной генетики, посвящённый изучению генома и генов живых организмов

Биоинформатика – наука о технических средствах исследования и моделирования макромолекул и их систем. Основные разделы – компьютерная геномика и метаболономика. Крупномасштабные биологические проблемы, требующие анализа больших объемов данных, решаются биоинформатикой с вычислительной точки зрения.

Картрирование – это Метод построения генетических карт – схем взаимного расположения структурных генов, регуляторных элементов и генетических маркеров, а также относительных расстояний между ними на хромосоме.

Структурные гены — гены, кодирующие информацию о первичной структуре белка.

ДНК-маркеры, или молекулярно-генетические маркеры — полиморфный признак,

выявляемый методами молекулярной биологии на уровне нуклеотидной последовательности ДНК для определенного гена или для любого другого участка хромосомы при сравнении генотипов различных особей, пород, сортов, линий.

Полиморфизм – это наличие нескольких наследственных вариантов, наиболее редкий из которых встречается с частотой, превышающей частоту обратного мутирования. На практике, признак или маркер считают полиморфным, если наиболее редкий вариант встречается чаще, чем в 1% наблюдений.

Экспрессия генов — процесс, в ходе которого наследственная информация от гена (последовательности нуклеотидов ДНК) преобразуется в функциональный продукт — РНК или белок.

Транскриптом - совокупность всех транскриптов, синтезируемых одной клеткой или группой клеток, включая мРНК и некодирующие РНК.

Ген – транскрибируемый фрагмент ДНК/РНК, кодирующий полипептид или функциональные РНК (рРНК, тРНК, мРНК, малые ядерные РНК).

Геном — совокупность наследственного материала, заключённого в клетке организма.

Секвенирование биополимеров —	определение	их	аминокислотной
или нуклеотидной последовательности.	В результате	секвенирования получают

формальное описание первичной структуры линейной макромолекулы в виде последовательности мономеров в текстовом виде. Размеры секвенируемых участков ДНК обычно не превышают 100 пар нуклеотидов (next-generation sequencing) и 1000 пар нуклеотидов при секвенировании по Сенгеру.

Открытая рамка считывания — последовательность нуклеотидов в составе ДНК или РНК, потенциально способная кодировать белок. Основным признаком наличия ORF служит отсутствие стоп-кодонов на достаточно длинном участке последовательности после стартового кодона.

Закрытая рамка считывания (closed reading frame) — рамка считывания, внутри которой в результате мутации возникает стоп-кодон.

Цистрон — термин, синонимичный термину «ген», обозначающий участок ДНК, ответственный за синтез определённого белка. У прокариот гены, выполняющие сходные метаболические функции, часто располагаются в функциональных единицах, называемых оперонами и их экспрессия регулируется совместно (полицистронный механизм регуляции активности генов). Оперон транскрибируется в виде молекулы РНК, кодирующей более одного гена / цистрона.

Амплификация ДНК- получение определенного фрагмента ДНК в больших количествах – размножение.

Аннотация генома – маркировка генов и других объектов внутри них. Метилирование ДНК – своеобразная модификация молекулы ДНК путем присоединения метильной группы (-CH3) к цитозину в составе CpG-динуклеотида. Один из способов регуляции работы генома без изменения нуклеотидной последовательности ДНК.

Секвенирование de novo – секвенирование нового для науки (ранее не прочитанного) генома.

Чтения (риды) – фрагменты ДНК (длиной от 25 до 20 000 нуклеотидов), считываемые с генома при помощи специальной машины — секвенатора Эпигеномика – один из разделов геномики, посвященный изучению изменения

экспрессии генов, вызванного механизмами, не затрагивающими последовательности ДНК, например, через метилирование ДНК.

РНК-интерференция — процесс подавления экспрессии гена на стадии транскрипции, трансляции, деаденилирования или деградации мРНК при помощи малых молекул РНК.

Малые интерферирующие РНК или короткие интерферирующие — это класс двухцепочечных РНК, длиной 20-25 нуклеотидов. Взаимодействие малых интерферирующих РНК с матричной РНК (мРНК) целевого гена приводит к деградации последней (в процессе РНК-интерференции), предотвращая трансляцию мРНК на рибосомах в кодируемый ею белок. В конечном итоге результат действия малых интерферирующих РНК идентичен тому, как если бы просто снижалась экспрессия гена. Могут просто садиться на последовательность мРНК, быть ей комплементарной и приволить в негодность, либо в 3’ нетранслируемую область присоединяться и блокировать трансляцию.

Вирусы-сателлиты – вирусы, способные реплицироваться только в присутствии других вирусов.

Нокдаун гена - снижение экспрессии разными методами на всех уровнях: блокирование транскрипции и трансляции, деградация мРНК…

Протеиновые ресурсы: