РАЗОБРАННЫЕ БИЛЕТЫ

Очистка нуклеотидов: электрофорез или хроматография.

Коррекция ошибок: контроль рамки считывания, удаление несовпадений, сайтспецифический мутагенез, рекомбинация

2.Рентгеноструктурный анализ белков.

Любая белковая молекула характеризуется уникальностью структуры (наличием определенных связей, геометрического расположения атомов), которая определяет уникальность ее функции

5.Рентгеноструктурный (кристаллографический) анализ – основан на получении кристаллов белка и восстановлении структуры электронных плотностей по рентгеновской интерференционной картинке. Позволяет определить пространственные координаты всех атомов исследуемого объекта. При наличии данных о положении отдельных атомов можно вычислить

межатомные расстояния, валентные углы, углы вращения вокруг связей, распределение поверхностного заряда и другие детали молекулярной геометрии.

Этапы рентгеноструктурного анализа:

7.Выделение и очистка белка. Необходимо много очень чистого растворимого белка (10-50 мг)

8.Кристаллизация. Необходимо наличие пересыщенного раствора – за счет постепенного испарения растворителя, либо исходя из температурной зависимости растворимости (развести в теплом, остудить – растворимость уменьшится); добавление веществ, понижающих растворимость, изменение pH и др. Для каждого конкретного белка подбираются свои условия кристаллизации. Кристаллы могут расти от нескольких дней до недель. Кристаллы 0,2-0,6 мм, без дефектов и с хорошей огранкой используют на следующем этапе.

Не из всех белков можно вырастить кристалл, поэтому этот этап является ограничителем рентгеноструктурного метода.

9.Рентгеновский эксперимент. В качестве источника рентгеновских лучей – синхротронный ускоритель. Его преимущества: мощность пучка (скорость; разрушение кристаллов под действием x-лучей – можно успеть пока он не разрушился), возможность получить желаемую длину волны (рентгеновские трубки дают пучок фиксированной длины).

Когда x-луч падает на кристалл, рассеяние в кристалле происходит на плоскостях в решетке из атомов. Появляются картины дифракции. Дифракционная картина представляет собой набор точек - рефлексов. Для каждой точки можно определить ее интенсивность и положение.

10.Интерпретация карт распределения электронной плотности. Построение приближенной атомной модели – на основе характеристик связей в исследуемой молекуле и факторов, влияющих на взаимное расположение аминокислотных радикалов.

11.Уточнение структуры математическими методами – последний этап. Цель – улучшить предварительную модель. Этот этап может быть довольно

длительным (от нескольких месяцев до года), т.к. необходимо много раз проверять модель. Для этого в основном используются компьютерные программы. Когда атомная модель белка получена, ее оформляют в соответствии со стандартами и помещают в банк белковых структур.

12.Помещение в банк белковых структур – Protein Data Bank.

РСА позволяет:

•Исследовать кристаллизованные белки и их комплексы с другими веществами

•Точнее других методов определять взаимное расположение атомов в кристалле

Трудности:

•Не все белки можно кристаллизовать

•Нужно очень много материала

•Чаще всего необходим синхротрон

•Структура белка в кристалле может быть не природной

Билет 6.

1.Понятие о клонирующем векторе, основные типы векторов. Векторы для клонирования крупных фрагментов ДНК.

Вектор для клонирования – молекула ДНК, способная к включению чужеродной ДНК и к автономной репликации, это инструмент для введения генетической информации в клетку. Это молекула-носитель для клонируемой ДНК. В зависимости от типа вектора и схемы эксперимента рекомбинантная ДНК может либо реплицироваться автономно, либо встроиться в хромосому клетки-хозяина.

Плазмидные векторы. Клонирующий лимит до ~10 тнп. Плазмида – короткая и обычно кольцевая молекула ДНК, которая плавает в цитоплазме бактериальной клетки. Плазмиды не связаны с бактериальной хромосомой, они могут реплицироваться независимо от нее.

Векторы должны иметь 3 характеристики:

1.Иметь сайт ori (последовательность нуклеотидов в геноме, на которых начинается инициация репликации) для репликации ДНК и размножения плазмиды в клетке;

2.Доминантный селективный маркер, позволяющий отобрать клетку, несущую плазмиду с встроенным фрагментом чужеродной ДНК (устойчивость к антибиотику);

3.Уникальный сайт рестрикции (встречающийся в векторе один раз).

Уникальный сайт разрезается рестриктазой, получается линейная ДНК, имеющая специфичные липкие концы. Ее смешивают с фрагментами клонируемой ДНК, также имеющей те же липкие концы. Отжиг и обработка ДНК-лигазой приводит к образованию плазмиды, содержащей чужеродную ДНК. Процесс встраивания фрагмента в плазмиду и трансформация плазмиды в клетке приводит к появлению трех типов клеток: не содержащие плазмиды, содержащие плазмиду без встройки и содержащие плазмиду со встройкой.

Недостаток плазмидных векторов: малая емкость в отношении клонируемых фрагментов ДНК. Выраженное делетирование больших вставок чужеродной ДНК в плазмидах связано с тем, что селективное преимущество в бактериях получают плазмиды с минимальным временем репликации.

Фаговые векторы. Центральную треть вирусного генома можно заменить чужеродной ДНК без нарушения жизненного цикла фага.

Фаг лямбда: Клонирующий лимит от 8 до 24 тпн. Плечи фага имеют все гены, необходимые для репликации. Между плечами находится фрагмент, не влияющий на репликацию, и на его место помещается заменяемый фрагмент ДНК. На стыке каждого из плеч и заменяемого фрагмента находится один и тот же сайт рестрикции, которого нет в плечах данного фага. В частицу фага лямбда может упаковаться около 15 тыс пар нуклеотидов (всего геном около 45, и на плечи приходится около 30). Фаги без вставок или со

слишком большими вставками не развиваются и не поражают бактерии.

Космидные векторы: созданы искусственно в результате комбинации плазмид и фага лямбда. Имеет последовательность ori, доминантный селекционный маркер amp, уникальные сайты рестрикции для клонирования ДНК, а также cos-сайты – участки, в которых многочисленные копии геномов лямбда-фага, объединенные в длинную цепь, разрезаются на фрагменты и пакуются в фаговые головки. Cos-сайты помогают упаковываться в лямбда-фагов, что

обеспечивает введение больших молекул ДНК в клетку. Сконструированы для клонирования больших фрагментов ДНК в 35–50 тпн.

Искусственные хромосомы. Разработка векторов типа искусственных хромосом началась для решения задачи клонирования и стабильного наследования больших фрагментов ДНК, например, для физического картирования генома в проектах расшифровки геномов, для стабильной экспрессии обширных генных комплексов в трансгенных клетках, для внедрения таких комплексов и отдельных генов в клеткумишень без нарушения ее хромосомных структур и т.д.

На основе бактерий BAC: сконструированы на основе полового фактора F E. coli со строгим контролем репликации. Его генетическая система обеспечивает правильное распределение фактора F между делящимися клетками и поддерживает его копийность в 1-2 молекулы на клетку. BAC-векторы позволяют клонировать фрагменты ДНК в 75–

300 тпн.

На основе дрожжей YAC: имеют теломеры на концах; центромерные последовательности (Cen); селективные маркеры на каждом плече; дрожжевые ориджины репликации; сайты рестрикции, уникальные для участков YAC и пригодные для инсерции ДНК. Клонирующий лимит – 100–1 000 тпн

Бактериальные и дрожжевые искусственные хромосомы применяют для создания геномных библиотек. Причем, структурная стабильность протяженных вставок ДНК в BAC-системе существенно выше, чем в YAC-системе, чем обусловлено широкое использование BAC-системы при физическом картировании генома человека, по которому затем собиралась его полная последовательность.

Дальнейшее развитие этого направления привело к созданию векторов на базе искусственных хромосом млекопитающих (MAC). Благодаря наличию основных структурных элементов обычных хромосом такие мини-хромосомы длительно удерживаются в клетках и способны нести полноразмерные (геномные) гены и их естественные регуляторные элементы, которые необходимы для правильной работы гена, в нужной ткани и в должное время.

*Челночный вектор – это вектор, с двумя сайтами инициации (ориджинами) репликации, способный реплицироваться в обоих хозяевах, ориджины которых он содержит.

2. Хроматографические методы разделения и очистки белков.

Хроматография – метод разделения и определения веществ, основанный на распределении компонентов между двумя фазами – подвижной и неподвижной. Неподвижная фаза – твердое пористое вещество, которое называется сорбентов или пленка жидкости, нанесенная на твердое вещество. Подвижная фаза – жидкость или газ, протекающий через неподвижную фазу.

Компоненты анализируемой смеси вместе с подвижной фазой передвигаются вдоль стационарной фазы. Неподвижная – обычно в трубе – колонке. В зависимости от силы взаимодействия с поверхностью сорбента компоненты будут перемещаться вдоль колонки с разной скоростью. Одни компоненты останутся в верхнем слое сорбента, другие, в меньшей степени взаимодействующие с сорбентом, окажутся в нижней части колонки, а некоторые и вовсе покинут ее вместе с подвижной фазой.

Достоинства хроматографии:

1.Разделение носит динамический характер, акты сорбции-десорбции повторяются многократно – это эффективно

2.При разделении используют различные типы взаимодействия сорбатов и неподвижной фазы: от чисто физических до хемосорбционных – возможность селективного разделения широкого круга веществ.

3.На разделяемые вещества можно накладывать различные дополнительные поля (гравитационное, магнитное и тд), которые расширяют возможности разделения

4.Это гибридный метод, сочетающий одновременно и разделение, и определение нескольких веществ.

5.Позволяет решать аналитические задачи (разделение, идентификация, определение) и препаративные (очистка, выделение, концентрирование). Все это можно делать в режиме реального времени.

Процесс: Сначала идет культивирование целевого белка в клетках. После этого клетки разрушаются (например, ультразвуком) и полученная масса центрифугируется. Полученный супернатант подвергают очистке. Белки предварительно могут денатурировать, чтобы они не различались по форме. Тип хроматографии выбирается на основе белка.

Кратко очистка проходит в 4 стадии:

1)посадка белка

2)смыв с колонки всего, что не связалось с ней,

3)элюирование белка

4)отмывка с колонки всего, что не элюировалось в зоне белка.

На всех этапах собирают фракции для анализа на содержание белка. Затем проводят электрофорез, для выявления чистоты фракций. Если степень чистоты не удовлетворяет, проводят ионообменную хроматографию.

Принцип ионообменной: ионообменная хроматография позволяет разделить молекулы, основываясь на ионных взаимодействиях. Неподвижная фаза имеет заряженные функциональные группы, которые взаимодействуют с анализируемыми ионизированными молекулами противоположного заряда. Этот вариант хроматографии классифицируется на два типа — катионную и анионную ионообменную хроматографию. Суть в том, что только положительно заряженные белки проходят сквозь колонку, а остальные остаются в ней. При изменении pH среды меняются заряды, и исходя из заряда выходят разные белки в зависимости от их суммарного заряда (аминокислотного).

Принцип эксклюзионной (гель-фильтрация): молекулы веществ разделяются по размеру за счёт их разной способности проникать в поры неподвижной фазы. При этом первыми выходят из колонки наиболее крупные молекулы, способные проникать в минимальное число пор стационарной фазы. Последними выходят вещества с малыми размерами молекул, свободно проникающие в поры. В отличие от ионообменной и

аффинной хроматографии молекулы образца не связываются с сорбентом – бОльшая свобода в изменении условий.

Принцип аффинной: в основе лежит реакция взаимодействия разделяемых примесей с лигандом, связанным с инертным носителем. В роли примесей выступают биологически активные вещества (белки, ферменты), вступающие с лигандом в биохимическое взаимодействие.

Примеры биоспецифических взаимодействий:

1)антиген, вирус, клетка – антитело,

2)Гормон, витамин – рецептор

3)фермент – субстрат, ингибитор, кофактор

4)ионы металлов – полигистидиновые последовательности, комплементарные

последовательности нуклеиновых кислот. (не для белков)

Именно высокая специфичность подобного взаимодействия обусловливает высокую эффективность аффинной хроматографии и её широкое (по сравнению с другими видами лигандной хроматографии) распространение. Суть в том, что она использует структурные особенности белков для разделения. Преимущества – высокая степень очистки, недостатки – загрязнение лигандом.

Это уникальная технология, так как только она помогает очистить биомолекулы на основе их биологической функции или химической структуры.

Конкретные примеры:

1)Иммобилизованный белок A (белок, выделенный с поверхности клеточной стенки золотистого стафилококка) широко используется для очистки lgG (иммуноглобулинов класса G) в препаративных и промышленных масштабах.

2)Белок G (экспрессируются в стрептококках групп C и G) связывается с альбумином. Имеет сходства с белком A, но отличается специфичностью, тем не менее, находит широкое применение для очистки иммуноглобулинов.

3)Гепарин часто используется в качестве лиганда для ДНК-связывающих белков (рестриктазы, полимеразы)

* Иммобилизация фермента – это прикрепление фермента к некоторому нерастворимому носителю, причем таким образом, чтобы фермент мог обмениваться с раствором молекулами субстрата и продукта.

Адсорбционная. Основана на различной способности отдельных компонентов смеси (в силу их различной полярности) адсорбироваться на поверхности твёрдой фазы сорбента. Подвижная фаза – жидкость. Для препаративных целей. В качестве сорбентов используются активированный древесный уголь, окись алюминия или кремния.

Осадочная. Основана на образовании труднорастворимых осадков в определённой последовательности. Разделяемые вещества, находящиеся в подвижной фазе, вступают

во взаимодействие с осадителем и образуют малорастворимые вещества — осадки. При дальнейшем пропускании растворителя происходят поочерёдно: растворение этих осадков, перенос вещества по слою неподвижной фазы, роматограммой в данном случае будет являться распределение осадков по слою носителя.

Распределительная. Основана на различной растворимости разделяемых веществ в двух малосмешивающихся жидкостях; в отличие от адсорбционной, твердая фаза служит опорой (основой) для стационарной (неподвижной) фазы. Разновидностью распределительной хроматографии является хроматография на бумаге, широко используемая в биохимических и клинических лабораториях для разделения белков, пептидов, аминокислот и других веществ.

Билет 7.

1. Составные элементы вектора на примере бактериальной экспрессионной плазмиды.

Экспрессионный вектор – вектор, содержащий необходимые элементы для трансляции клонируемой ДНК (экспрессионная кассета с сигналами транскрипции и трансляции, часто репрессор промотора).

Плазмидные векторы. Должны иметь 3 характеристики:

1.Иметь сайт ori (участок инициации репликации) для репликации ДНК и размножения плазмиды в клетке;

2.Доминантный селективный маркер, позволяющий отобрать клетку, несущую плазмиду с встроенным фрагментом чужеродной ДНК (устойчивость к антибиотику);

3.Уникальный сайт рестрикции (встречающийся в векторе один раз).

Уникальный сайт разрезается рестриктазой, получается линейная ДНК, имеющая специфичные липкие концы. Ее смешивают с фрагментами клонируемой ДНК, также имеющей те же липкие концы. Отжиг и обработка ДНК-лигазой приводит к образованию плазмиды, содержащей чужеродную ДНК. Процесс встраивания фрагмента в плазмиду и трансформация плазмиды в клетке приводит к появлению трех типов клеток: не содержащие плазмиды, содержащие плазмиду без встройки и содержащие плазмиду со встройкой.

Типичный экспрессионный бактериальный вектор обычно содержит следующие элементы:

1)Ориджин репликации – сайт инициации. Его структура определяет число копий – количество молекул на клетку и его совместимость с другими

векторами. В одной клетке могут сосуществовать только вектора с ориджинами репликации из разных групп совместимости.

2)Селективный ген, предназначенный для отличия трансформированных клеток (гены устойчивости к антибиотикам). Для ампициллина это ген устойчивости к бэта-лактамазе.

3)Множественный клонирующий сайт – состоит из близко расположенных уникальных сайтов нескольких эндонуклеаз рестрикции (полилинкер).

МКС – множественный клонирующий сайт, RBS (ribosome binding site) – сайт связывания рибосом, обеспечивает связывание прокариотической рибосомы за счет комплементарности 3'-концевой части 16S рибосомальной рРНК с матричной мРНК

4)Сигнальные и регуляторные элементы экспрессии. Бывают универсальные и специфические. Необходимы для экспрессии клонированного гена. (например, лактозный оперон). Составной частью

любого экспрессионного вектора является экспрессионная кассета, которая включает все необходимые сигнальные и регуляторные элементы, позиционированные относительно клонируемого в МКС гена. Для бактерий это промотор, обычно строго регулируемый, регуляторные элементов транскрипции и трансляции (в том числе энхансеры и структуры, стабилизирующие мРНК), сайт связывания рибосом, терминаторы трансляции и транскрипции. Использование сильных промоторов и регуляторных элементов позволяет достигать высоких уровней экспрессии целевого продукта. Для E. coli традиционно популярны лактозный lac и триптофановый trp промоторы и их гибрид tac.

5)Ген-репрессор транскрипции (в случае синтеза токсичного для клетки целевого белка) – позволяет строже регулировать синтез и не зависеть от клеточной регуляторной системы.

6)Дополнительные фрагменты для экспрессии целевого гена в виде фьюжинов. В основном для аффинной очистки. В состав экспрессионной кассеты часто вводят различные эпитопы (часть макромолекулы антигена, которая распознаётся иммунной системой), при этом целевой белок синтезируется в виде N- или C-концевого фьюжина (гибридного белка – полученного объединением двух или более генов, изначально кодировавших отдельные белки). Цели могут быть различными – повышение уровня экспрессии целевого белка, его стабильности, улучшение его растворимости и сворачиваемости в нативную конформацию и другие, но чаще всего такие эпитопы (таги) вводят для

аффинной очистки синтезируемого белка. Как правило, присоединяют такие белковые фрагменты через последовательности, содержащие сайты расщепления специфических протеаз. В этом случае после очистки

рекомбинантного белка лишние последовательности можно удалить протеазной обработкой.

7)Редкие кодоны, снижающие скорость трансляции. Для каждого типа организмов существует своя предпочтительная частота использования кодонов и, соответственно, свой концентрационный набор изоакцепторных транспортных тРНК. Таким образом, плохая трансляция целевого гена, имеющего в своем составе редкие для клетки-мишени кодоны, может происходить вследствие низкой внутриклеточной концентрации тРНК, узнающей такие кодоны. Проблему можно решить химико-ферментативным синтезом целевого гена с соответствующей организму-рецепиенту частотой использования кодонов (оптимизация гена).

2. Основные методы разделения и очистки белков.

Разделение белковых смесей основана на различных свойствах белков:

1.Осаждение белка – результат снижения растворимости при добавлении солей (высаливание), органики или изменения температуры.

Высаливание – это добавление растворов нейтральных солей (Na2SO4, (NH4)2SO4). Анионы (SO42–) и катионы (Na+, NH4+) взаимодействуют с зарядами белка (группы NH4+ и COO–). В результате заряд исчезает, и соответственно, исчезает взаимоотталкивание молекул. Одновременно резко уменьшается гидратная оболочка. Это ведет к "слипанию" молекул и осаждению.

Пример: Так как белки плазмы крови отличаются по размерам, заряду, строению, то можно подобрать такие количества соли, которые вызовут осаждение менее устойчивых белков, пока другие еще будут растворены.

Например, подобным образом раньше определяли соотношение альбумины/глобулины в плазме крови. Альбумины, как более полярные молекулы, остаются в растворенном состоянии при 50% насыщении раствора нейтральными солями, в то время как глобулины в этих условиях уже осаждаются. В норме соотношение альбумины/глобулины в плазме крови равно

1,2-1,8.

2.Изоэлектрическое осаждение – при приближении рН раствора к изоэлектрической точке, белок теряет заряд и осаждается из раствора (пример: осаждение казеина молока при его скисании). Этот процесс

осаждения в начальных стадиях носит обратимый характер и может быть использован для разделения белков.

Изоэлектрическая точка – кислотность среды, при которой определённая молекула или поверхность не несёт электрического заряда.