Презентации 2020 / 08-20-GP-Proteomics

Common methods for PPI-detection

Co-precipitation

Re-constitution of complexes using purified components Analytical ultracentrifugation

X-ray crystallography and NMR spectroscopy Native electrophoretic techniques

Genetic methods: Yeast two-hybrid assays, Identification of suppressor mutations

Foёrster/fluorescence resonance energy transfer (FRET) Bioluminescence resonance energy transfer (BRET)

Protein-fragment complementation assay (PCA)

The last two groups of the methods allow to visualize PPI in living cells

	Исследования белок-белковых взаимодействий
	методом комплементации фрагментов репортера
			(РСА)
		Схема обнаружения	Используемые белки-репортеры
	взаимодействия белков А и Б
		НетВзаимодействиевзаимодействия	- дигидрофолат-редуктаза
			- бета-лактамаза
			- TEV протеаза
	А	Б	- светлячковая люцифераза	Биолюм.
			- люцифераза из коралла Renilla	репортеры
			- люцифераза из копепод Gaussia
			- флуоресцентные белки (GFP, YFP, RFP…)
		Есть активность	способные к формированию
		Нет активности
		(регистрация света)	комплементирующих фрагментов

Structure of photoprotein obelin

Compact globular structure of the obelin molecule is formed by two-helix domains each from 4 - helix

Ca2+-binding site I

Ca2+-binding site II

Ca2+-binding site III

Design of fusion constructs for development of obelin complementation assay

	Fusion scheme	Zip
		Zip-dimer
	Splitting point	ObN

		Zip
	ObC	Light
		Substrate
	flexible linker	Registration of
		interaction

Zip 14 aa Ob N-part (or C)

Positive control - yeast GCN4 leucine zipper-forming sequences (Zip) that homodimerize