Оптические методы в биофизике: люминесцентный анализ биологических объектов

Аннотация

Флуоресцентная спектроскопия — эффективный метод исследования динамических процессов в растворах, представляющих интерес для биологов. Целью данной лабораторной работы является изучение способов применения оптических методов в биофизике, а именно люминесцентного анализа биологических объектов. В рамках работы проводилась регистрация спектров флуоресценции пигментов в трех средах: в целом листе, в водном гомогенате и в ацетоновом экстракте (было установлено, что максимум флуоресценции пигментов при переходе от целого листа к водному гомогенату и ацетоновому экстракту смещается в сторону более коротких волн). Далее проводилась проверка линейности зависимости интенсивности люминесценции пигментов от их концентрации — линейной зависимости на всем графике выявлено не было, но был выявлен участок, на котором она наблюдается (для разведений 1:64, 1:32 и 1:16 в количественных долях). Пигменты, флуоресцирующие в растворе, также, были определены — ими оказались хлорофиллы. Были рассчитаны энергии флуоресцентного состояния для всех образцов (они располагаются в интервале значений от 1,056*10^{-6 до}1,16*10^-6 эВ).

1. Введение

Люминесценция — испускание фотонов из электронно-возбужденных состояний — делится на два типа в зависимости от природы основного и возбужденного состояний. Один из этих типов — флуоресценция —испускание, происходящее при возвращении спаренного электрона на более низкую орбиталь. Такие переходы квантовомеханически «разрешены», а типичные величины скоростей испускания для них ~10⁸ с ^-.

Флуоресцентные свойства объекта обычно характеризуют спектрами испускания и возбуждения. Спектр испускания флуоресценции — это зависимость интенсивности флуоресценции от длины волны (в нанометрах) или волнового числа (в см^-1). Спектры испускания зависят как от химической структуры флуорофора, так и от растворителя, в котором он растворен. Спектр возбуждения — это зависимость интенсивности люминесценции при определенной длине волны от длины волны возбуждения. Для большинства флуорофоров квантовые выходы и спектры испускания не зависят от длины волны возбуждающего света. Следовательно, спектр возбуждения флуорофора обычно совпадает с его спектром поглощения. Даже при идеальных условиях для такого совпадения необходимо присутствие единственного флуорофора, а также отсутствие осложняющих факторов, таких, как нелинейность, связанная с большой оптической плотностью образца.

Квантовый выход флуоресценции — это отношение числа испущенных фотонов к числу поглощенных.

Флуоресценция молекул имеет следующие характеристики:

1. Стоксов сдвиг

2. Независимость спектра испускания от длины волны возбуждения

3. Правило зеркальной симметрии

4. Времена затухания и квантовый выход флуоресценции.

Для регистрации спектрального состава люминесценции используют приборы, называемые спектрофлуориметрами или люминесцентными спектрометрами (рис.1).

Рисунок 1. Блок-схема спектрофлуориметра

В качестве источника возбуждающего света (1) в приборе чаще всего используется ксеноновая лампа. Прибор снабжен монохроматорами (3,6) для выделения отдельной длины волны как возбуждающего, так и испускаемого света. Оба монохроматора снабжены моторами, что обеспечивает автоматическое сканирование по длинам волн. Кроме того, в устройстве используются линзы (2) и поворотное зеркало (4) для того, чтобы правильно направить поток света в кювету (5). Флуоресценция попадает на фотоумножители (7) и затем количественно измеряется с помощью соответствующих электронных устройств. Выходной сигнал обычно представляется графически на мониторе компьютера или встроенном дисплее (8).

Флуоресцентная спектроскопия — эффективный метод исследования динамических процессов в растворах, представляющих интерес для биологов. Такая возможность связана в первую очередь с временем жизни возбужденных состояний. Поскольку только те молекулы растворителя, которые непосредственно соседствуют с поглощающими частицами, будут влиять на их спектр поглощения, абсорбционная спектроскопия может дать информацию лишь о некоторой средней сольватной оболочке растворителя, соседствующей с хромофором, и не отражает молекулярную динамику. В противоположность этому параметры флуоресцентной спектроскопии являются чувствительными функциями всех процессов, протекающих за время жизни возбужденного состояния, причем в этих процессах могут участвовать молекулы, находящиеся в момент возбуждения на расстояниях до 100 А от флуорофора.