2. Материалы и методы

   1. Регистрация спектров флуоресценции пигментов. Лист растения разделяется на 3 части: 1-ая часть исследуется в целом виде, из 2-ой части готовится водный гомогенат, а из 3-ей – ацетоновый экстракт.

Далее проводится регистрация спектров флуоресценции растительных пигментов в трех образцах:

- целом листе (кусок листа располагается в кювете по диагонали, 60 к направлению возбуждающего луча)

- водном гомогенате (в кювету добавляется 2 мл, раствор не густо окрашен, слегка зеленый)

- ацетоновом экстракте (в кювету добавляется 2 мл).

Условия регистрации спектров: длина волны возбуждения — 430 нм, диапазон сканирования — 600-800 нм, скорость сканирования — 6 нм/с, высокое напряжение на ФЭУ выбирается исходя из уровня сигнала на длине волны 680 нм.

2. Проверка линейности зависимости интенсивности люминесценции пигментов от их концентрации. Спектры люминесценции пигментов в ацетоновом экстракте измеряются несколько раз (разведенный экстракт в 2, 4, 8, 16, 32 и 64 раза). Для этого из кюветы забирается 1 мл исходного экстракта и добавляется 1 мл ацетона. Перемешайте содержимое кюветы перемешивается и измеряется спектр (условия аналогичные п. 2.1). Повторив данную манипуляцию еще 5 раз, получаем спектры разведений 1/4, 1/8, 1/16, 1/32 и 1/64.

3. Результаты

   1. Спектры люминесценции растений были зарегистрированы в 3-х средах: целом листе, водном гомогенате, ацетоновом экстракте. Нормирование экспериментальных данных проводилось путем деления значения интенсивности для каждой длины волны на максимально высокое значение из всего ряда данных.

Полученные спектры приведены ниже (график 1).

График 1. Нормированные спектры люминесценции пигментов в 3-срадах.

2. Было произведено 6 последовательных разведений, в ходе чего получено 7 растворов различных концентраций (базовый раствор и разведенные в 2, 4, 8, 16, 32, 64 раза).

График 2. Ненормированные спектры люминесценции пигментов в ацетоновом экстракте при различных разведениях (от разведения 1:1 до 1:64 в количественных долях).

3. Аналогично п.3.1 были определены максимальные значения интенсивности люминесценции, но уже для ацетонового экстракта и построен график зависимости этой характеристики от концентрации вещества.

График 3. Зависимость максимальной интенсивности люминесценции ацетонового экстракта от концентрации Imax(C) (концентрация выражена в долях от единицы).

Ниже приведена таблица, отражающая максимальные значения интенсивности флуоресценции и длин волн, на которых они были зафиксированы, для всех образцов.

Таблица 1. Параметры измеренных спектров люминесценции.

№	Образец	Длина волныmax, нм	Imax, отн.ед
1	Целый лист	737	1,98929
2	Водный гомогенат	684	4,0818
3	Ацетоновый экстракт (1:1)	680	5,43389
4	Ацетоновый экстракт (1:2)	677	21,7463
5	Ацетоновый экстракт (1:4)	674	56,3779
6	Ацетоновый экстракт (1:8)	673	82,9706
7	Ацетоновый экстракт (1:16)	672	81,5508
8	Ацетоновый экстракт (1:32)	669	54,2062
9	Ацетоновый экстракт (1:64)	669	31,7588

4. Энергия флуоресцентного состояния (в см^-1) в каждом образце была рассчитана через волновое число — величину, которая часто используется в прикладной физике, в том числе в спектроскопии (рассчитывается как k=2п/длина волны). Количество энергии, которую требуется рассчитать, может быть взято как волновое число в см^-1, не являющееся само по себе единицей энергии. Однако эта величина может быть непосредственно преобразована в единицы энергии из расчета, что 1 см^-1 — это 1,23984*10^-4 эВ. Расчеты приведены ниже.

Таблица 2. Энергии флуоресцентного состояния для экспериментальных образцов.

Образец	Длина волныmax, нм	Волновое число (см^-1)	Энергия (эВ)
Целый лист	737	0,008521	1,05647*10^-6
Водный гомогенат	684	0,0091813	1,13833*10^-6
Ацетоновый экстракт (1:1)	680	0,0092353	1,14503*10^-6
Ацетоновый экстракт (1:2)	677	0,0092762	1,1501*10^-6
Ацетоновый экстракт (1:4)	674	0,0093175	1,15522*10^-6
Ацетоновый экстракт (1:8)	673	0,0093314	1,15694*10^-6
Ацетоновый экстракт (1:16)	672	0,0093452	1,15866*10^-6
Ацетоновый экстракт (1:32)	669	0,0093871	1,16386*10^-6
Ацетоновый экстракт (1:64)	669	0,0093871	1,16386*10^-6

4. ВЫВОДЫ

   1. В эксперименте мы наблюдали спектры пигментов хлорофиллов — они флуоресцируют в красной области (625-740). Предположительно в эксперименте участвовали следующие разновидности хлорофиллов: хлорофилл а (I_max при длине волны 669 нм — экспериментальное значение совпало с табличным) и, скорее всего, хлорофилл с (I_max при длине волны 684 нм, что всего на 6 нм меньше, чем табличное значение). Небольшое отклонение этой величины от табличного значения может быть связано с присутствием в растворе посторонних примесей, способных немного сдвигать спектр.

   2. Максимум флуоресценции пигментов при переходе от целого листа к водному гомогенату и ацетоновому экстракту смещается в сторону более коротких волн. Сдвиг спектров может быть объяснен разницей в состоянии электронов – в ацетоне они находятся в более возбужденном состоянии по сравнению с водным раствором, а в водном растворе по сравнению с целым листом. Ацетон является наиболее полярным растворителем из них, поэтому максимум флуоресценции в нем наблюдается при более коротких волнах.

   3. Были рассчитаны энергии флуоресцентного состояния для всех образцов — они располагаются в интервале значений от 1,056*10^{-6 до}1,16*10^-6 эВ.

   4. Максимум флуоресценции пигментов в ацетоновом экстракте при уменьшении концентрации смещается, что можно связать с уменьшением оптической плотности растворов.

   5. Линейность зависимости интенсивности люминесценции пигментов от их концентрации не выполняется. При переходе от наименьших концентраций к более высоким наблюдается сначала увеличение интенсивности люминесценции, а затем ее уменьшение. Изменяются и длины волн от более коротких к более длинным. Таким образом, флуоресценция существенно возрастает, а затем уменьшается из-за реабсорбции испускаемой красной флуоресценции в полосе поглощения хлорофилла. Реабсорбция обусловлена перекрытием коротковолновой области спектра флуоресценции хлорофилла с длинноволновой областью его спектра поглощения. Получается, что пригодным для проведения количественного анализа можно считать диапазон концентраций от 1:64 до 1:16 в количественных долях (что соотносится и с законом Бугера-Ламберта-Бера, который работает преимущественно при низких концентрациях).

Список использованных источников (дополнительных):

1. [Электронный ресурс]. Режим доступа: http://laser-portal.ru/content_893 (дата обращения: 31.10.2020).