- •ВВЕДЕНИЕ
- •1.1. Используемое сырье и материалы
- •1.2. Сведения о применяемом оборудовании
- •1.3. Содержание технологического процесса
- •1.3.1. Подготовка технологических сред
- •1.3.1.1. Получение сжатого воздуха
- •1.3.1.2. Получение воды очищенной
- •1.3.1.3 Подготовка питательных растворов
- •1.3.1.4. Паровая стерилизация в автоклаве MLS 3781L
- •1.3.2. Получение посевного материала
- •2. БИОСИНТЕЗ БАКТЕРИЙ В ФЕРМЕНТЕРЕ BIOFLO (7,5 л.)
- •2.1. Подготовка сырья, материалов и оборудования к биосинтезу бактерий Cupriavidus eutrophus В10646
- •2.2. Подготовка к работе ферментера BioFlo115 (7,5л.)
- •3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСНОВНЫХ КИНЕТИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ МИКРОБНОГО БИОСИНТЕЗА
- •3.2. Удельная скорость роста микроорганизмов
- •3.3. Время удвоения биомассы
- •3.4. Экономический коэффициент
- •СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Министерство образования и науки Российской Федерации Сибирский федеральный университет
Культивирование микроорганизмов в ферментере BioFlo115(7,5л.)
Методические указания к лабораторному практикуму
Электронное издание
Красноярск
СФУ
2016
УДК 57.083.13(07) ББК 28.4я73
К906
Составители: Барановский Сергей Викторович Демиденко Алексей Владимирович Киселев Евгений Геннадьевич
К906 Культивирование микроорганизмов в ферментере
BioFlo115(7,5л.) : методические указания к лабораторному практикуму [Электронный ресурс] / сост. С.В. Барановский, А.В. Демиденко, Е.Г. Киселев. – Электрон. дан. – Красноярск : Сиб. федер. ун-т, 2016. – 42 с. – Систем. требования: PC не ниже класса
Pentium I; 128 Mb RAM; Windows 98/XP/7/8/10; Adobe Reader V8.0 и
выше. – Загл. с экрана.
В данное пособие включены практические рекомендации авторов по проведению процесса глубинного аэробного культивирования микроорганизмов на основании реализации современных технологических решений основных и вспомогательных процессов биосинтеза. Пособие позволит студентам получить практические навыки основ биотехнологии культивирования как в рамках лаборатории, так и в промышленных масштабах.
Предназначено для бакалавров направления 06.03.01 «Биология», профиля «Бионженерия и биотехнология» (06.03.01.11), а также магистров направления 06.04.01 «Биология» программы «Микробиология и биотехнология» (06.04.01.01).
УДК 57.083.13(07) ББК 28.4я73
© Сибирский федеральный университет, 2016
Электронное учебное издание
Подготовлено к публикации издательством Библиотечно-издательского комплекса
Подписано в свет 10.05.2016. Заказ № 1400 Тиражируется на машиночитаемых носителях
Библиотечно-издательский комплекс Сибирского федерального университета 660041, г. Красноярск, пр. Свободный, 82а
Тел. (391) 206-26-67; http://bik.sfu-kras.ru E-mail: publishing_house@sfu-kras.ru
ВВЕДЕНИЕ
Термин биотехнология включает составляющие «биос», «техне», «логос» греческого происхождения (от греч. «биос» – жизнь, «техне» – искусство, мастерство, умение и «логос» – понятие, учение). Таким образом, биотехнология по существу сводится к использованию микроорганизмов, животных и растительных клеток или же их ферментов для синтеза, разрушения или трансформации (превращения) различных материалов с целью получения полезных продуктов для различных нужд человека, а также рациональному использования ресурсов биосферы и охраны окружающей среды.
Целью настоящих методических указаний является формирование у студентов представлений о принципах технологического решения и аппаратурного оснащения процесса биосинтеза бактерий, получение практических навыков ведения основных биотехнологических процессов и расчета их кинетических параметров в промышленной микробиологии.
Данные методические указания разработаны для проведения лабораторных практикумов и работ по направлению «Культивирование микроорганизмов в ферментёре BioFlo115 (7,5л.)». Учебно-методические указания устанавливают основные требования к организации, безопасному проведению и обеспечению заданных технологических параметров процесса биосинтеза, контролю качества получаемого биоматериала. В качестве биологического агента используется бактерия Cupriavidus eutrophus В10646.
Предназначены для подготовки студентов по направлениям 06.03.01
и06.04.01 «Биология» укрупненной группы 060000 «Естественные науки».
Вучебно-методические указания включены следующие разделы:
-общие сведения о технологии культивирования Cupriavidus eutrophus В10646;
-биосинтез бактерий в ферментёре BioFlo115 (7,5л.);
-определение основных кинетических параметров микробного биосинтеза.
3
1.ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ О ТЕХНОЛОГИИ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ
CUPRIAVIDUS EUTROPHUS B 10646
1.1.Используемое сырье и материалы
Для культивирования бактерий Cupriavidus eutrophus В10646 используют в качестве основного субстрата глюкозу, минеральное сырье и материалы (таблица 1). Применяемые материалы и комплектующие (покупные) изделия должны соответствовать требованиям нормативной и технической документации. Соответствие материалов предъявляемым требованиям должно подтверждаться документами предприятий – поставщиков и входным контролем по ГОСТ 24297-2013. Допускается замена материалов на другие, характеристики которых соответствуют назначению и условиям эксплуатации.
Таблица 1 – Сведения о сырье и материалах
|
Наименование материала |
Нормативная |
|
|
документация |
||
|
2 2 |
||
ГОСТ 975-88 |
|||
Глюкоза (C H |
O ) |
||
Карбамид ((NH ) CO) |
ГОСТ 6691-77 |
||
Натрий фосфорнокислый двузамещеный (Na2HPO4×12H2O) |
ГОСТ 4172-76 |
||
Калий фосфорнокислый однозамещенный (KH2PO4) |
ГОСТ 4198-75 |
||
Магний сернокислый (MgSO4×7H2O) |
ГОСТ 4523-77 |
||
Железо лимоннокислое (С6Н5О7Fe×H2O) |
ТУ6-09-01719-87 |
||
Купорос медный (CuSO4×5H2O) |
ГОСТ 19347-99 |
||
Марганец хлористый (MnCl2×4H2O) |
ГОСТ 612-75 |
||
Никель хлористый (NiCl2) |
ГОСТ 4038-79 |
||
Купорос цинковый (ZnSO4×7H2O) |
ГОСТ 8723-75 |
||
Кобальт хлористый (CоCl2×6H2O) |
ГОСТ 4525-77 |
||
Кислота борная (H3BO3) |
ГОСТ 9656 |
||
Спирт этиловый технический (С2Н5ОН) |
ГОСТ 18300-87 |
||
Реактив Несслеpа |
ТУ 6-09-2089-77 |
||
|
|
||
Калия гидроокись (КОН) |
ГОСТ 24363-80 |
||
Кислота соляная (НСl) |
ГОСТ 3118-77 |
||
Кальций хлористый (CaCl2) |
ГОСТ 450-77 |
||
Пробирка |
|
ГОСТ 1770-74 |
|
Цилиндр 1-250 или 3-250, 1-10 или 23-100,1-1000 или 3-1000 |
ГОСТ 20292-74 |
||
Стаканчик СН 45/13, 60/14 |
ГОСТ 25336-82 |
||
Колба КН-2-250-34 ТХС |
ГОСТ 25336-82 |
||
|
|
|
|
|
4 |
|
Наименование материала |
Нормативная |
|
документация |
||
|
||
|
|
|
Колба КН-1-250; 1-500; 1-1000; 1-2000 |
ГОСТ 25336-82 |
|
|
|
|
Воронка ВФ-1-32 пор ТХС или любого типа с таким же |
ГОСТ 25336-82 |
|
фильтром |
||
|
||
|
|
|
Колба мерная; 25; 50; 100; 250; 500; 1000; 2000 мл |
ГОСТ 1770-74 |
|
Колба круглодонная |
ГОСТ 25336-82 |
|
|
|
|
Палочка стеклянная |
|
|
Пипетка стеклянная: 1; 2; 10; 25 мл |
ГОСТ 29169-91 |
|
Спиртовка |
ГОСТ 25336—82 |
|
Пробирка центрифужная 2 мл |
Eppendorf |
|
|
|
|
Стаканы центрифужные, 2 л |
|
Также для осуществления процесса биосинтеза используется:
-воздух сжатый, который должен соответствовать первому классу чистоты по ГОСТ Р ИСО 8573-4-2005, ГОСТ Р 52539-2006. Класс фильтрации F7+F9+H14, остаточное содержание масла - не более 0,01 мг/м3; твердых частиц по размеру - не более 5 мкм, по количеству - не более 0,1 мг/м3; влаги в жидкой фазе - не более 0,003 г/м3; точка росы сжатого воздуха - не выше минус 70°C; допустимое число КОЕ в 1 м3 - не более 5;
-вода питьевая применяется на бытовые и технические нужды;
-вода очищенная питьевая (вода очищенная) 1 типа применяется для приготовления питательных сред, ополаскивания ферментационного оборудования;
-вода дистиллированная используется для приготовления аналитических растворов, ополаскивания посуды.
Вода питьевая в процессе производства должна удовлетворять гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения СанПиН 2.1.4.1074-01.
Вода очищенная должна соответствовать стандарту качества ГОСТ Р
52501-2005 (ISO 3696:1987):
-электропроводность: 0,055 мкСм/см (18,2 МОм*см);
-содержание ТОС в воде: не более 5 мкг/л (без встроенной ультрафиолетовой (УФ) лампы);
-микроорганизмы: не более 1 КОЕ/1000 мл;
-частицы: не более 1 в миллилитре.
Вода, дистиллированная, ГОСТ 6709-72.
5
1.2. Сведения о применяемом оборудовании
Для проведения процесса ферментации, а также подготовки питательных сред используется современное высокотехнологичное оборудование. Основное технологическое оборудование и приборы представлены в таблице 2.
Таблица 2 – Основное технологическое оборудование и приборы
Наименование, марка, модель, |
|
Назначение |
|||||
|
производитель |
|
|
||||
|
|
|
|||||
Компрессор СБ4/Ф-150.OL150II |
|
Получение сжатого воздуха |
|||||
ЗАО «REMEZA» (р. Беларусь) |
|
||||||
|
|
||||||
|
|
||||||
Магистральный фильтр с индикатором |
Получение сжатого воздуха; Удаление |
||||||
AFF8C-F04D-T |
|
|
|
|
загрязнений: масла, воды и механических |
||
SMC PNEUMATICS (Япония) |
|
примесей, чистота фильтрации |
|||||
|
|
|
|
|
|
микрочастиц 99 % |
|
|
|
||||||
Осушитель холодильного типа IDFA8E-23 |
Получение сжатого воздуха; |
||||||
SMC PNEUMATICS (Япония) |
|
Осушка сжатого воздуха (4-6 класс ISO |
|||||
|
|
|
|
|
|
8573-1), отделение конденсата. |
|
|
|
|
|
||||
Субмикрофильтр |
с |
предфильтром и |
Получение сжатого воздуха; Удаление |
||||
индикатором AMH350C-F04D-T |
|
сажи, частиц пыли размером более 0,01 |
|||||
SMC PNEUMATICS (Япония) |
|
мкм, масляного тумана в виде аэрозоля, |
|||||
|
|
|
|
|
|
чистота фильтрации микрочастиц 99,9 % |
|
|
|
|
|||||
Фильтр-регулятор AW40-F04H |
|
Получение сжатого воздуха. Тонкая |
|||||
SMC PNEUMATICS (Япония) |
|
очистка и регулировка давления |
|||||
|
|
|
|
|
|||
arium® |
comfort |
I |
«Sartorius Weighing |
Получение воды очищенной |
|||
Technology» (Германия) |
|
|
|||||
|
|
|
|||||
|
|
|
|
|
|
||
arium® bagtank |
|
|
|
|
|
||
«Sartorius |
Weighing |
Technology» |
Хранение воды очищенной |
||||
(Германия) |
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
||||
Аквадистиллятор ДЭ-25 |
|
|
Получение дистиллированной воды |
||||
«Электромедоборудование» (Россия) |
|
||||||
|
|
||||||
|
|
|
|
||||
Вертикальный |
|
программируемый |
Подготовка питательных растворов, |
||||
стерилизатор (автоклав) |
MLS |
3781L |
|||||
стеклянной посуды |
|||||||
SANYO Biomedical products (Япония) |
|||||||
|
|||||||
|
|
|
|
||||
Насос перистальтический |
ISM |
1020A |
Подготовка питательных растворов; |
||||
ISMATEC (Англия) |
|
|
|
Стерилизующая фильтрация глюкозы |
|||
|
|
|
|
|
|||
Фильтр |
стерилизующий |
Express |
SHC |
Подготовка питательных растворов; |
|||
Millipore (США) |
|
|
|
|
Стерилизующая фильтрация глюкозы |
||
|
|
||||||
Весы лабораторные аналитические Pioneer |
Подготовка питательных растворов; |
||||||
PA512C OXAUS (Швейцария) |
|
Формование плёнок и мембран |
|||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
6 |
|
Наименование, марка, модель, |
Назначение |
|||
производитель |
|
|||
|
|
|||
Весы лабораторные аналитические Ohaus |
Получение посевного материала; |
|||
Discoveri DV214CD OXAUS (Швейцария) |
Микробиологический контроль; |
|||
|
|
|
Химический контроль; Входной контроль |
|
|
|
|
биомассы |
|
|
|
|
||
Плитка электрическая |
с магнитным |
Подготовка питательных растворов; |
||
перемешиванием MR Hei-Standart Heidolph |
Входной контроль биомассы; |
|||
(Германия) |
|
|
Формование плёнок и мембран |
|
|
|
|||
Шкаф-ламинар MB 602WSL |
Получение посевного материала; |
|||
M-Biotek (Корея) |
|
Микробиологический контроль |
||
|
|
|
||
Шкаф СВЧ LG MS2042DS |
|
Получение посевного материала; |
||
LG Electronics (Корея) |
|
Микробиологический контроль |
||
|
|
|
|
|
Холодильник |
бытовой |
компрессионный |
Получение посевного материала; |
|
Бирюса 151ЕК-2 |
|
|||
|
Микробиологический контроль |
|||
ОАО КЗХ Бирюса (Россия) |
||||
|
||||
|
|
|
||
Шкаф сушильный UN55 |
|
Микробиологический контроль; |
||
Memmert (Германия) |
|
Сушка полимера |
||
|
|
|
|
|
Пипеточный |
дозатор |
1-канальный |
Получение посевного материала; |
|
механический |
с варьируемым объемом |
Микробиологический контроль; |
||
дозирования |
|
|
Химический контроль; |
|
Sartorius (Германия) |
|
Входной контроль биомассы; |
||
|
|
|
Выращивание инокулята |
|
|
|
|||
Петля микробиологическая |
Получение посевного материала; |
|||
Bochem (Германия) |
|
Микробиологический контроль |
||
|
|
|
||
Термостат SHELLAB |
|
Получение посевного материала; |
||
Sheldon (США) |
|
|
Микробиологический контроль |
|
|
|
|||
Шейкер-инкубатор INNOVA44 |
|
|||
New Brunswick Scientific, |
|
Получение посевного материала |
||
Eppendorf (Германия) |
|
|
||
|
|
|||
Ферментёр BioFlo115 7,5 л. (США) |
Выращивание инокулята |
|||
Центрифуга Micro-6 |
|
Химический контроль |
||
HANIL (Корея) |
|
|
||
|
|
|
||
|
|
|
||
Центрифуга Combi 514 R |
|
Химический контроль |
||
HANIL (Корея) |
|
|
||
|
|
|
||
|
|
|||
Центрифуга AVANTI J-HC |
Концентрирование биомассы |
|||
Beckman Coulter (Германия) |
||||
|
||||
|
|
|
||
Фотометр КФК-3 |
|
Химический контроль |
||
ЗОМЗ (Россия) |
|
|
||
|
|
|
||
|
|
|
|
|
ТИОН А50 |
|
|
Обеззараживание воздуха рабочей зоны |
|
ООО Аэросервис (Россия) |
|
|||
|
|
|||
|
|
|
|
|
ТИОН А100 |
|
|
Обеззараживание воздуха рабочей зоны |
|
ООО Аэросервис (Россия) |
|
|||
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
7 |
|