ПЦР исследования практического врача

ухода от иммунного ответа.

•Природная устойчивость к антибиотикотерапии.

3.2.2.3. Материал для исследований

Наибольшую диагностическую значимость при выявлении ДНК М. hominis

иM. genitalium методом ПЦР имеют следующие биологические материалы:

•соскоб из уретры (п. 2.1.);

•соскоб из цервикального канала (п. 2.2.);

•соскоб с задней стенки влагалища (диагностика бактериального вагиноза) (п. 2.3.);

•соскоб с задней стенки глотки (у новорожденных) (п. 2.7.);

•секрет предстательной железы, сперма (п. 2.4.);

•осадок мочи (п. 2.5.).

3.3.Трихомониаз

3.3.1.Краткая информация о возбудителе

Трихомоноз (трихомониаз) занимает первое место по распространенности среди инфекций, передающихся половым путем. По данным ВОЗ, примерно 170180 млн человек ежегодно заболевают трихомониазом. В целом пораженность взрослого населения в популяции составляет 8-10%. Среди лиц с воспалительными заболеваниями урогенитального тракта эта цифра составляет 32-35 %.

Возбудителем заболевания является Trichomonas vaginalis, простейший одноклеточный микроорганизм, приспособившийся в процессе эволюции к паразитированию в мочеполовых органах человека. Для выживания в организме хозяина у них имеется несколько механизмов: способность проникать подобно лейкоцитам между клетками хозяина в узкие щели, фиксация на поверхности клетки трихомонады большого количества антитрипсина, с одной стороны, и протеолитических ферментов (гиалуронидаза и т. п.) — с другой. Ферменты трихомонад легко разрушают иммуноглобулины урогенитального тракта. Трихомонады фагоцитируют целый ряд других возбудителей ИППП — гонококков, хламидий, микоплазм, грибов, обеспечивая этим микроорганизмам защиту от воздействия антибиотиков.

Моноинфекция трихомонадами встречается не более чем в 10% случаев. В основном трихомонадная инфекция имеет сочетанное с другими возбудителями течение. Наиболее частыми и тяжелыми осложнениями (последствиями) хронического трихомонадного поражения являются обтурационные процессы в семенных канатиках и маточных трубах. Трихомониаз — одна из основных причин трубного бесплодия. Это обусловлено тем, что в ответ на воздействие трихомонадной гиалуронидазы возникают грубые рубцы и спайки.

Заражение трихомониазом происходит от больного человека. Без лечения влагалищные трихомонады не покидают организм человека и способны вызывать различные осложнения.

11

В ответ на трихомонадную инфекцию вырабатываются АТ к трихомонаде классов IgG, IgM, которые, однако, не способны осуществлять иммунную защиту, а являются лишь «свидетелями» инфекции.

Трихомониаз часто протекает субъективно бессимптомно: до 61% женщин и до 83% мужчин, у которых обнаруживают трихомонады, не предъявляют никаких жалоб. При беременности, в послеродовом или послеабортном периоде, при чрезмерной сексуальной активности, на фоне приема алкоголя, снижения иммунологической реактивности скрытая форма трихомониаза может перейти в острую.

Для успешной диагностики трихомониаза следует придерживаться следующих принципов [И. И. Ильин, Е. Н. Туранова, 1991]:

•сочетанное использование различных способов диагностики;

•неоднократные исследования изучаемого материала;

•взятие материала из разных очагов (уретра, мочевой пузырь, вульва, вагина, протоки больших вестибулярных желез);

•правильная техника взятия и транспортировка материала.

Взятие клинического материала для выявления трихомонад осуществляют из всех возможных очагов инфекции (у женщин в начале и конце менструального кровотечения). Химическая провокация путем инстилляции в уретру и обработки цервикального канала растворами азотнокислого серебра нецелесообразна в связи с губительным действием этих растворов на влагалищную трихомонаду. Выявлению простейших в большом числе случаев способствуют повторные многократные исследования.

ПЦР-исследование позволяет с высокой специфичностью обнаруживать трихомонаду в различных биологических материалах: мазках из уретры, цервикального канала, семенной жидкости, соке простаты. В настоящее время после культурального метода ПЦР — самый надежный и перспективный метод. В крупных межклинических исследованиях совпадение результатов ПЦР и культурального составило 99,7-100%.

3.3.2.Материал для исследований

• соскоб из уретры (п. 2.1.);

• соскоб из цервикального канала (п. 2.2.);

• соскоб с задней стенки влагалища (п. 2.3.);

• секрет предстательной железы, сперма (п. 2.4.).

3.4.Диагностика бактериального вагиноза

3.4.1.Краткая информация

Микробиоценоз влагалища — сложившаяся экологическая система, основная функция которой — защитная. Микрофлора влагалища способна реагировать качественными и количественными изменениями на любые физиологиче-

12

ские и патологические сдвиги в состоянии макроорганизма и препятствовать инвазии патогенных микроорганизмов.

Ведущее место в вагинальном микробиоценозе занимают лактобактерии (80-90%), число которых может достигать 109 КОЕ/мл. Колонизируя слизистую влагалища, лактобактерии участвуют в формировании экологического барьера и обеспечивают тем самым резистентность вагинального биотопа.

Нарушение нормальной микрофлоры влагалища приводит к возникновению переходного состояния — бактериального вагиноза, наиболее широко распространенного заболевания у женщин детородного возраста.

Бактериальный вагиноз (БВ) — это переходное состояние вагинального биотопа, характеризующееся замещением лактофлоры G. vaginalis и условно-пато- генной анаэробной флорой, в первую очередь представителями семейства

Bacteroides, Mobiluncus, M. hominis и U. urealyticum.

Предварительный диагноз БВ может быть поставлен при наличии у пациентки трех из четырех перечисленных ниже признаков:

•наличие «ключевых» клеток при цитологическом исследовании урогенитального мазка;

•рН влагалищного отделяемого >4,5;

•специфический характер выделений;

•положительный аминотест.

Окончательное установление диагноза БВ возможно только на основании данных о состоянии микрофлоры влагалища. Комплексная диагностика состояния вагинальной микрофлоры, основанная на сочетании цитологического исследования и ПЦР анализа позволяет выявить изменения вагинальной микрофлоры, характерные для БВ:

•резкое снижение количества или отсутствие лактобактерий;

•увеличение количества G. vaginalis, грамотрицательных анаэробных бактерий — Mobiluncus curtissi, Bacteroides spp., а также M. hominis и U. urealyticum;

•наличие «ключевых» клеток при цитологическом исследовании урогенитального мазка и наличие или отсутствие лейкоцитарной реакции.

3.4.2.Лактобактерии (Lactobacillus spp.)

Лактобактерии (Lactobacillus spp.) занимают ведущее место в вагинальном микробиоценозе (80-90%) (в норме 106-109 КОЕ/мл).

Колонизируя слизистую влагалища, лактобактерии участвуют в формировании экологического барьера и обеспечивают тем самым резистентность вагинального биотопа, препятствуя инвазии патогенных микроорганизмов. Нарушение нормальной микрофлоры влагалища приводит к резкому снижению титра лактобактерии или полному их исчезновению. Происходит замещение лактофлоры G. vaginalis и условно-патогенной анаэробной флорой, в первую очередь

13

представителями семейства Bacteroides, Mobiluncus, M. hominis и U. urealyticum.

Выявление лактофлоры методом ПЦР позволяет оценить состояние вагинального микробиоценоза, используя принцип доказательной медицины.

К примеру, выявление лактофлоры на фоне отсутствия представителей условно-патогенной флоры свидетельствует о нормальном состоянии вагинального биотопа. При обнаружении как лактобактерии, так и какого-либо другого микроорганизма можно предположить переходное состояние, тогда как отсутствие лактофлоры свидетельствует о серьезных нарушениях состояния микробиоценоза влагалища — бактериальный вагиноз или вагинит

Преимущества полуколичественного определения лактобактерий методом ПЦР:

1.Быстрота получения результатов.

2.Возможность проведения комплексной диагностики (из одной пробы определяется большой спектр микроорганизмов).

Чувствительность тест-системы адекватна выявлению лактобактерий в титре 106 КОЕ/мл.

3.4.3.Материал для исследования

•мазок из заднего и бокового сводов влагалища (п. 2.3.).

Не рекомендуется взятие мазков из цервикального канала или уретры, поскольку их микрофлора не идентична и не может характеризовать БВ, хотя и несет определенную информацию о наличии воспалительного процесса.

3.4.4.Интерпретация результатов

Алгоритм интерпретации результатов комплексного лабораторного исследования биотопов влагалища представлен в таблице 1.

3.5.Гонорея

3.5.1.Краткая информация о возбудителе

Возбудителем гонореи является Neisseria gonorrhoeae — грамотрицательный диплококк, имеющий форму кофейных зёрен, обращённых своей вогнутой поверхностью друг к другу. Гонококки имеют хорошо выраженные трёхслойную наружную стенку и цитоплазматическую мембрану, цитоплазму с рибосомами и ядерной вакуолью. Гонококки обычно располагаются внутриклеточно в протоплазме лейкоцитов, обычно группами, но иногда можно видеть и внеклеточных гонококков. Исследования гонококков в последние годы указывают на изменения их биологических свойств (наличие капсул, фагосом, Р-лактамазы, снижение чувствительности к антибиотикам, появление L-форм).

Гонококки поражают слизистые оболочки, в частности мочеиспускательного канала, влагалища, прямой кишки, полостей рта, носа, гортани. Процесс может распространяться на предстательную железу, семенные пузырьки, придатки яичек, яичко, семявыносящие протоки, а у женщин — на матку, яичники, маточные

14

					Таблица 1
		Комплексное лабораторное исследование состояния биотопа влагалища.
		Результат ПЦРYисследования	Результат микроскопического	Заключение	Рекомендации
			исследования мазка
		Lactobacillus spp (+) >106
		Gardnerella vaginalis (Y)	Эпителиальных клеток
		Mycoplasma hominis (Y)	соответственно фазе МЦ;	НОРМОЦЕНОЗ	Норма.
		Ureaplasma urealyticum (Y)	доминирование лактобактерий,
		Moblluncus curtlsil (Y)	отсутствие грамотрицательной флоры.
		Bacteroides spp (Y)
		Lactobacillus spp (Y) <106
		Gardnerella vaginalis (Y)	Лейкоциты — в небольшом
		Mycoplasma hominis (Y)	количестве; полное отсутствие в	KОМПЕНСИРОВАННЫЙ	Наблюдение, повторное исследование
		Ureaplasma urealyticum (Y)	исследуемом материале микрофлоры	БАKТЕРИАЛЬНЫЙ ВАГИНОЗ	через 1Y2 месяца.
		Moblluncus curtisii (Y)	при неизменных эпителиоцитах.
		Bacteroides spp (Y)
		Lactobecillus spp (Y) <106	«Kлючевые» клетки единичные в поле
		Gardnerella vaglnalls (Y)	зрения; умеренный лейкоцитоз
		Mycoplasma hominis чаще (+)	(15Y25 лейкоцитов в поле зрения);	СУБKОМПЕНСИРОВАННЫЙ	Заместительная терапия (местное
		Ureaplasma urealyticum.. чаще (+)	возрастание количества	БАKТЕРИАЛЬНЫЙ ВАГИНОЗ	лечение лактобактерином).
		Moblluncus curtlsil (+) или (Y)	сопутствующей грамвариабельной
		Bacteroides spp.(+) или (Y)	полиморфной бактериальной флоры.
		Lactobacillus spp (Y) <106
		Gardnerella vaginalis (+)	Лейкоциты в умеренном количестве;		Этиотропное лечение
		Mycoplasma hominis (+)	присутствие бактериальной флоры в	ДЕKОМПЕНСИРОВАННЫЙ	(антибактериальная терапия,
		Ureaplasma urealyticum (+)	виде монокультуры или в различных	БАKТЕРИАЛЬНЫЙ ВАГИНОЗ	направленная в основном против
		Moblluncus curtisii (+)	морфоY и видовых сочетаниях.		анаэробной флоры).
		Bacteroides spp (+)
			Большое количество лейкоцитов,
		Lactobacillus spp (Y) <106	макрофагов, эпителиальных клеток,		Проведение дополнительного
		Gardnerella vaginalis (Y)	выраженный фагоцитоз,	НЕСПЕЦИФИЧЕСKИЙ ВАГИНИТ	микробиологического исследования
		Mycoplasma hominis (Y)	морфологический пейзаж		на наличие возбудителя (посев с
		Ureaplasma urealyticum (Y)	воспалительного процесса на фоне	При выявлении ИППП —	выделением чистой культуры с
		Moblluncus curtisii (Y)	полного отсутствия лактобактерий и	СПЕЦИФИЧЕСKИЙ ВАГИНИТ	определением чувствительности к
		Bacteroides spp (Y)	отсутствии явно выраженного		антибиотикам), ПЦРYиследование.
15			этиотропного возбудителя.

трубы. Распространяясь по кровяному руслу, гонококки могут иногда вызывать гонококковый сепсис и метастазы в различные органы. При гонококковой бактериемии поражаются суставы, глаза, плевра, эндокард, мышцы, кости, нервы. У новорождённых поражаются глаза, развиваются конъюнктивит, кератит.

3.5.2.Материал для исследования

При подозрении на наличие гонококковой инфекции исследуют:

•отделяемое мочеиспускательного канала (п. 2.1.);

•мазок из цервикального канала (п. 2.2.);

•мазок из носоглотки (п. 2.8.);

•парауретральных протоков;

•большой железы преддверия влагалища;

•стенок влагалища (п. 2.3.);

•секрет предстательной железы (п. 2.4.);

•семенных пузырьков, желез и лакун мочеиспускательного канала;

•мочу (п. 2.5.);

•промывные воды прямой кишки;

•отделяемого с конъюнктивы глаза (п. 2.6.).

3.6.Вирус папилломы человека

3.6.1.Краткая информация о возбудителе

Вирусы папилломы человека (ВПЧ) считаются агентами, отвечающими за предраковые поражения гениталий и плоскоклеточный рак у мужчин и женщин. Папилломавирусы видоспецифичны и тканеспецифичны. У человека описано более 60 различных папилломавирусов [De Villiers E. M., 1989]. Они поражают только поверхностный эпителий кожи и слизистых. Большинство бородавок, вызванных ВПЧ, спонтанно регрессирует, но при некоторых поражениях, особенно плоского эпителия, наблюдается озлокачествление. Принято с достаточной достоверностью, что ВПЧ ответственен за развитие остроконечных кондилом и что он связан с развитием плоской кондиломы шейки матки и с цервикальной интраэпителиальной неоплазией. Различные типы ВПЧ связаны с различными видами поражений.

Типы вирусов папилломы человека и вызываемые ими болезни представлены ниже [R. C. Reichman, 1987].

Тип вируса	Болезни
1	Подошвенные и ладонные бородавки
2	Обыкновенные бородавки
3, 10, 28, 29	Плоские бородавки
4	Подошвенные и обыкновенные бородавки
5,8-9, 12, 14-15, 17, 19-25, 36, 39, 40	Бородавчатая эпидермодисплазия
6, 11	Остроконечные кондиломы (генитальные

16

	бородавки), неоплазия шейки матки, па-
	пилломатоз гортани
7	Обычные бородавки у людей, контакти-
	рующих с мясом и животными
13, 32	Фокальная гиперплазия эпителия (болезнь
	Хека)
16, 18	Плоскоклеточное интраэпителиальное по-
	ражение, инвазивный рак. 99,7 % раков
	шейки матки ассоциировано с этими типа-
	ми ВПЧ
31, 33, 35	Генитальная дисплазия и карциномы
30, 45, 51, 56	Редкие формы рака, плоскоклеточные по-
	ражения полового члена
26, 27	Бородавки больных с ослабленным имму-
	нитетом
34, 37, 38	Отдельные случаи доброкачественных
	и злокачественных новообразований

Очень много данных свидетельствуют о возможной роли ВПЧ-инфекции в развитии рака у человека. Папилломавирусы чрезвычайно широко распространены и эпителиотропны. Это очень важно, так как известно, что большинство раковых опухолей человека представляют собой злокачественные образования, состоящие из эпителиальных клеток. В течение последних 10 лет установлено, что инфекция, вызванная ВПЧ, связана с развитием предраковых поражений половых органов — внутриэпителиальных неоплазий шейки матки, вульвы, влагалища, ануса, полового члена, а также плоскоклеточного рака. Описаны различные пути, объясняющие генез карциномы из вирусных папиллом шейки матки.

ВПЧ инфекция очень распространена в общей популяции. При обследовании женщин студенческого возраста у 26% ВПЧ обнаружен при первичном приеме и у 46% — в последующие 3 года наблюдения. У женщин с нормальной кольпоцитологией ВПЧ выявляются в 10-25% случаев (как правило, неонкогенные типы). При измененной кольпоскопической картине и кольпоцитологии доля женщин, инфицированных онкогенными типами, достигает 32-47%.

3.6.2.Материал для исследования

Материал для исследования оптимально брать при кольпоскопии с пораженных участков шейки матки и цервикального канала (п.2.2.). Допускается взятие материала без кольпоскопии из цервикального канала и уретры у женщин, и уретры и головки полового члена у мужчин.

17

4.ПЦР в клинической практике: диагностика вирусных гепатитов

Для специальностей: гастроэнтерология, гепатология, инфекционные болезни

4.1.Вирусный гепатит В

4.1.1.Краткая информации о возбудителе.

Вирус гепатита В (HBV) является ДНК-содержащим вирусом, в ряду вирусных гепатитов был открыт одним из первых. Наличие четких серологических маркеров и наличие у вируса поверхностной частицы — HBsAg — существенно облегчает его диагностику. При гепатите В может происходить развитие хронического гепатита, цирроза и первичного рака печени. Кроме того, с наличием бессимптомного носительства вируса связаны трудности борьбы с этой инфекцией. О вирусоносительстве судят по обнаружению HBsAg. По данным ВОЗ, в мире проживает более 300 млн носителей вируса, из которых около 5 млн россиян. Одна из особенностей вируса гепатита В — чрезвычайно высокая инфекционность.

Лабораторная диагностика острого и хронического гепатита В включает в себя определение нескольких серологических маркёров инфицирования вирусом гепатита В: HBsAg, ДНК HBV (ПЦР-исследование), HBeAg, IgM анти-НВс, антиНВс, анти-НВе и анти-HBs. Последовательное их появление и исчезновение при остром, и хроническом гепатите В позволяет судить о характере инфекционного процесса и активной репликации вируса. Длительное время считали, что только при наличии IgM анти-НВс и HBeAg имеет место активная репликация вируса гепатита В. Тестирование ДНК HBV, которое можно осуществить при помощи ПЦРисследований, выявило наличие в сыворотках крови HBsAg без HBeAg, или даже с анти-НВе-позитивной реакцией, свидетельствующей об активной репликации вируса. Секвенирование этой ДНК позволило установить существование мутантных форм вируса гепатита В, обозначенных как Pre-Core мутанты. Заболевание, обусловленное этой формой HBV, протекает тяжелее, быстро переходит в цирроз и дает худшие результаты интерферонотерапии.

4.1.2.Материал для исследования

• сыворотка крови (п. 2.11.).

4.2.Вирусный гепатит С

4.2.1.Краткая информация о возбудителе

С открытием в 1989 г. вируса гепатита С (HCV) началось интенсивное изучение HCV-инфекции, являющейся основной причиной развития хронических диффузных заболеваний печени и гепатоцеллюлярной карциномы. Хроническая инфекция вируса гепатита С представляет серьезную проблему для здравоохранения во всем мире. Распространенность ее в популяции колеблется от 0.5-1%

18

(Северная Европа, Бельгия) до 4-10% (Африка, Ближний Восток, Восточная Европа, Азия).

Отличительной особенностью вируса гепатита С является способность к длительной персистенции в организме, что обусловливает высокий уровень хронизации инфекции — в 50-80% случаев.

Генотипы HCV имеют важное биологическое значение: их гетерогенность может определять тяжесть течения гепатита. Гетерогенность генотипов создает трудности при разработке диагностических тест-систем и профилактических вакцин. В настоящее время известно 6 основных генотипов HCV и более 80 субтипов. В разных регионах мира распределение генотипов неравномерно: в Северной Америке превалирует генотип 1а, в Северной и Центральной Европе чаще встречаются 1b, 2а, на Ближнем и Среднем Востоке — 3а. В ряде исследований показано, что генотип 1b сочетается с более высоким уровнем виремии и низким от-

ветом на лечение α-интерфероном.

Образующиеся вируснейтрализующие антитела являются высокоспецифичными и не способны нейтрализовать вновь появляющиеся вирусные варианты, что также создает условия для «иммунологического ускользания» и не исключает возможности повторного инфицирования. В патогенезе поражения органов при HCV-инфекции обсуждаются прямой цитопатический эффект вируса и вызванные им иммунологические реакции, обусловливающие повреждение печени и других органов и тканей; репликация вируса вне печени — в тканях лимфоидного и нелимфоидного происхождения. Размножение вируса в иммунокомпетентных клетках (лимфоцитах) приводит к нарушению их иммунологической функции.

Для диагностики HCV-инфекции используются иммуноферментный метод (ELISA) для определения антител и ПЦР. Использование ПЦР позволяет подтвердить HCV инфекцию в спорных случаях и при отсутствии антител к HCV, встречающемся в 10% случаев, в том числе при алкогольной болезни печени, у лиц, получающих иммуносупрессивную терапию или имеющих криоглобулинемию. Большое значение этот метод имеет для ранней диагностики ОВГС и HCV-инфек- ции у доноров, для контроля за перинатальной передачей вируса, определения показаний к противовирусной терапии и оценки ее эффективности.

4.2.2.Материал для исследования

• сыворотка крови (п. 2.11.).

4.3.Вирусный гепатит D

4.3.1.Краткая характеристика возбудителя:

Вирус гепатита D (HDV, произносится как «дельта») относится к РНК-содер- жащим вирусам. Заражение дельта гепатитом возможно только при наличии вируса гепатита В (точнее, его поверхностной частицы — HBsAg). Это определяет

19

две основных формы инфицирования дельта вирусом: коинфицирование — одновременное заражение HDV и HBV; и суперинфицирование — заражение HDV носителя HBV («бессимптомного» носителя HBsAg или больного хроническим гепатитом В). Так же, как и при других вирусных гепатитах, большое значение для постановки диагноза и контроля заболевания имеют диагностические маркёры инфицирования. К ним относят: дельта-антиген, антитела к дельта-антигену классов IgM и IgG, тестируемые в ИФА, а также РНК HDV (определяется ПЦР). HDV может ассоциироваться с широким спектром клинических проявлений заболевания, от бессимптомного носительства до фульминантного гепатита и цирроза печени.

4.3.2.Материал для исследования

• сыворотка крови (п. 2.11.).

4.4.Вирусный гепатит G

4.4.1.Краткая характеристика возбудителя

Вслед за открытием вирусов гепатитов А и В последовала идентификация возбудителей гепатитов С, D и Е. Наличие случаев заболевания, при которых не удается выявить маркеры инфицирования этими вирусами, позволило предположить существование еще нескольких вирусных гепатитов. Открытие вирусов, ответственных за развитие гепатита G, и разработка методов их выявления и тестирования маркеров инфицирования вызвали интенсивное накопление фактических данных.

Дальнейший прогресс в исследовании гепатита G стал возможен лишь после разработки в 1993 г. новых молекулярно-биологических методов, т. е. ПЦР-ис- следований, позволяющих целенаправленно идентифицировать новые вирусы.

Вирус гепатита G (HGV), так же, как и НСV, относят к семейству Flaviviridae. Геном вируса представлен одноцепочечной РНК. По своей организации геном HGV подобен РНК HCV.

Основным маркером, применяемым для диагностики и изучения эпидемиологии гепатита G, является выявление РНК вируса гепатита G методом ПЦР. В отличие от гепатита С, выявление антител при гепатите G не может быть использовано для поиска вирусоносителей, а пригодно для регистрации уже прошедшей инфекции и проведения эпидемиологических исследований для оценки распространения инфекции в различных группах населения.

Несмотря на пристальный интерес к проблеме гепатита G, количество работ, посвященных изучению клинических проявлений этой инфекции, ограничено. Вероятнее всего, это можно объяснить редким выявлением случаев моноинфекцнн гепатита G. Так, при анализе структуры заболеваемости острыми вирусными гепатитами в США (1982-95 гг.) из 10533 заболевших у 322 (3%) зарегистрирован острый гепатит ни А, ни Е. При исследовании на наличие РНК HGV 45 таких больных позитивный результат отмечен у 4 (9%).

20